視網(wǎng)膜錐細(xì)胞失功能大鼠致病基因的鑒定.pdf

1、視網(wǎng)膜包括視桿與視錐兩種神經(jīng)回路，分別負(fù)責(zé)暗（弱光）視覺、無色視覺和明（強(qiáng)光）視覺、色覺信息的接受、加工和傳導(dǎo)，這兩種感光系統(tǒng)之間存在著復(fù)雜的聯(lián)系。色覺是視覺的高級功能，色覺異常疾病在男性中的發(fā)病率可高達(dá)8％，是一種常見的遺傳疾病，被認(rèn)為是視覺傳導(dǎo)通路中一些基因的重組或點(diǎn)突變導(dǎo)致的。但由于缺乏先天性色覺異常疾病的模式動(dòng)物，對其發(fā)病機(jī)制的研究難以深入，因此，目前色覺異常疾病的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)并培育了一種先天性視網(wǎng)膜錐細(xì)胞

2、失功能（retinalconedysfunction,RCD）大鼠，其遺傳表型為暗適應(yīng)視網(wǎng)膜電圖基本正常，明適應(yīng)視網(wǎng)膜電圖消失；組織結(jié)構(gòu)學(xué)結(jié)果顯示視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)層次完整，光感受器數(shù)量無明顯變化。本研究將對此模式動(dòng)物的致病基因、突變方式及功能等進(jìn)行研究，旨在了解該模式動(dòng)物的發(fā)病機(jī)制。
　　方法：
　　1.建立突變型大鼠與野生型BN大鼠的雜交品系，得到的F1代大鼠雌雄配對，獲得F2代大鼠。通過建立遺傳家系，明確遺傳方式。后續(xù)研究主要

3、以F2代大鼠為研究對象。
　　2.采用國際標(biāo)準(zhǔn)臨床視網(wǎng)膜電圖記錄方法，進(jìn)行表型鑒定。
　　3.應(yīng)用序列標(biāo)簽位點(diǎn)(sequencetaggedsite，STS)和單倍體型（haplotype）分析方法，定位突變基因。
　　4.針對候選基因，采用基因克隆、測序等方法確定基因的突變方式，并觀察突變基因是否與表型一致。
　　5.應(yīng)用熒光實(shí)時(shí)定量PCR方法和免疫熒光方法，觀察突變基因在模式大鼠中的mRNA表達(dá)水平以及蛋白表

4、達(dá)水平。
　　6.采用蘇木精-伊紅染色及全視網(wǎng)膜鋪片方法比較突變是否會(huì)影響不同年齡段的大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和錐體細(xì)胞的數(shù)量。
　　7.記錄不同光強(qiáng)、頻率及顏色光刺激下的視覺電生理反應(yīng)，分析光感受器細(xì)胞的功能。
　　結(jié)果：
　　1.將雌性突變型大鼠與雄性野生型BN大鼠雜交，子一代互交，收集到雜交二代大鼠共441只，所有大鼠均經(jīng)過臨床視覺電生理學(xué)檢測確定其表型。根據(jù)NCBI網(wǎng)站中提供的序列標(biāo)簽位點(diǎn)作為分子標(biāo)記物設(shè)計(jì)引物，對

5、441只F2代大鼠分別進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增。通過比較分子標(biāo)記物在不同個(gè)體中的擴(kuò)增產(chǎn)物，分析突變基因與分子標(biāo)記物間的交換重組率，結(jié)果顯示突變基因與DXRat21和DXRat96有連鎖關(guān)系，并位于X染色體的末端端粒區(qū)27.8Mb的區(qū)域內(nèi)。此區(qū)域內(nèi)共有169個(gè)候選基因，只有中波長視蛋白基因與視覺有關(guān)。
　　2.針對中波長視蛋白基因的的6個(gè)外顯子分別設(shè)計(jì)引物、擴(kuò)增并測序，結(jié)果顯示第四內(nèi)含子3’端剪接位點(diǎn)處保守的AG雙堿基突變?yōu)锳T雙堿基

6、。此突變在441只F2代大鼠中，除雄性正常表型大鼠外，其余個(gè)體中均存在；且在50只野生型SD大鼠和156種近交系大鼠中均未被發(fā)現(xiàn)。
　　3.反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和熒光實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)果顯示，野生型SD大鼠中可以檢測到中波長視蛋白基因mRNA的表達(dá)，但是突變型大鼠中無法檢測到該基因mRNA的表達(dá)，表明其轉(zhuǎn)錄過程受到抑制；免疫熒光結(jié)果顯示，花生凝集素特異性標(biāo)記的錐體細(xì)胞在野生型和突變型大鼠中均可以檢測到，且正常表型的野生型SD

7、大鼠中還可以檢測到中波長視蛋白的表達(dá)，但突變型大鼠中無法檢測到，中波長視蛋白在突變型大鼠中未被表達(dá)。
　　4.蘇木精-伊紅染色方法觀察1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月、9個(gè)月和12個(gè)月野生型SD大鼠和突變型大鼠的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示突變型大鼠的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)、光感受器細(xì)胞層的厚度與同齡的野生型SD大鼠相比均未發(fā)生明顯變化；全視網(wǎng)膜鋪片結(jié)果表明，同齡的突變型大鼠和野生型大鼠的錐體細(xì)胞的數(shù)量無明顯差異。中波長視蛋白在野生型大鼠中表達(dá)，而突變型大鼠中

8、無法檢測到該蛋白的表達(dá)。
　　5.視覺電生理學(xué)記錄結(jié)果顯示，在暗適應(yīng)條件下，隨著刺激光強(qiáng)的增強(qiáng)，記錄到的視網(wǎng)膜電圖（electroretinogram，ERG）反應(yīng)的波幅值在突變型和正常表型大鼠中均逐漸增大；明適應(yīng)條件下，不同頻率、光強(qiáng)的光刺激均顯示出隨著光強(qiáng)的增強(qiáng)，正常表型大鼠的波幅值逐漸增大，直至達(dá)到飽和狀態(tài)，而突變型大鼠即使在最大光強(qiáng)刺激下也無法記錄到任何波形。顏色光刺激后，在明適應(yīng)環(huán)境中，突變型大鼠仍然無法記錄到任何波形。

9、
　　結(jié)論：
　　中波長視蛋白基因中內(nèi)含子和外顯子間保守的剪接位點(diǎn)發(fā)生了點(diǎn)突變，導(dǎo)致該基因無法被正常的剪接，不能轉(zhuǎn)錄成成熟的mRNA，蛋白質(zhì)的翻譯過程也被終止。感光視蛋白與11-順式視黃醛結(jié)合形成視錐細(xì)胞中的感光色素，由于基因突變致使蛋白無法合成，錐體細(xì)胞感光后的感光換能機(jī)制受到了抑制，所以在視覺電生理學(xué)檢測中顯示為無法檢測到錐體細(xì)胞的功能，表現(xiàn)為明適應(yīng)下無任何波形。中波長視蛋白基因的突變會(huì)導(dǎo)致綠色盲或者綠色弱疾病的產(chǎn)生，所

10、以模式大鼠為綠色色覺異常大鼠。
　　迄今為止發(fā)現(xiàn)的中波長視蛋白基因的突變或是由于基因重組，或是由于外顯子中的點(diǎn)突變引起，而該基因內(nèi)含子的剪接位點(diǎn)突變屬于首例，這為研究中波長視蛋白基因的功能、結(jié)構(gòu)等方面提供了更多的機(jī)遇。藍(lán)色錐體全色盲（blueconemonochromatism，BCM）疾病表現(xiàn)為感紅（長波長）和感綠（中波長）錐體細(xì)胞功能喪失，而感藍(lán)（短波長）錐體細(xì)胞和視桿細(xì)胞的功能正常。由于大鼠中只存在感綠（中波長）和感藍(lán)（短波