基于配體的朊病毒蛋白分析新方法.pdf

1、朊病毒病(priondiseases)是一類(lèi)致死性神經(jīng)退行性疾病，是細(xì)胞型朊蛋白(cellularprionprotein，PrPC)經(jīng)構(gòu)象轉(zhuǎn)變形成致病型朊蛋白(scrapie prion protein，PrPSc)的結(jié)果。上世紀(jì)末歐洲瘋牛病的大范圍爆發(fā)及其由牛傳染給人的新型克雅氏病的發(fā)現(xiàn)使得人們“談牛色變”，并迫使歐盟迅速建立朊病毒病檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法。朊病毒病的診斷尤其是早期診斷既能實(shí)現(xiàn)該疾病流行趨勢(shì)的監(jiān)控、確保肉類(lèi)產(chǎn)品、輸血、手術(shù)、

2、血庫(kù)和血漿產(chǎn)品安全，又使得該病在永久性腦損傷發(fā)生前即可進(jìn)行有效治療。基于朊病毒病抗體的傳統(tǒng)檢測(cè)方法因抗體制備復(fù)雜、與靶物的親和力和特異性不高等缺點(diǎn)而無(wú)法應(yīng)用于朊病毒病的早期診斷中。因此簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的朊病毒病早期診斷方法亟待建立。朊病毒蛋白配體因能夠特異性的與朊蛋白相互作用而得到科學(xué)工作者的廣泛關(guān)注。如適配子是一類(lèi)新興的與靶物具有很高的親和力和選擇性的核酸配體，自發(fā)現(xiàn)以來(lái)就因具抗體無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)成為抗體替代物在各個(gè)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。本

3、文將配體應(yīng)用于朊病毒病分析中，建立了一系列基于配體的朊病毒蛋白分析方法。主要研究?jī)?nèi)容如下：
　　 1.單標(biāo)記aptamer分子燈標(biāo)的設(shè)計(jì)及朊蛋白的檢測(cè)中。根據(jù)G堿基在距離適當(dāng)時(shí)能猝滅染料如羅丹明、熒光素等的熒光的性質(zhì)，本文設(shè)計(jì)了基于G堿基猝滅的單標(biāo)記適配子分子燈標(biāo)，成功解決了分子燈標(biāo)雙標(biāo)記的操作復(fù)雜、成本高、適配子親和力下降等問(wèn)題。將所設(shè)計(jì)的適配子分子燈標(biāo)應(yīng)用于朊病毒蛋白檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，在朊病毒蛋白濃度為1.1-44.7μg/mL時(shí)

4、，熒光強(qiáng)度與蛋白濃度呈現(xiàn)很好的線(xiàn)性關(guān)系，檢測(cè)限為0.3μg/mL(3σ)。與傳統(tǒng)的抗體檢測(cè)方法相比，本文所建立的方法簡(jiǎn)單、快速且選擇性高。
　　 2.基于適配子和汞離子的朊蛋白免標(biāo)記檢測(cè)。根據(jù)T堿基能與Hg相互作用形成T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，本文建立了基于適配子和Hg2+的免標(biāo)記的朊病毒蛋白檢測(cè)方法。研究結(jié)果表明，適配子與Hg2+作用后形成鏈間雙鏈結(jié)構(gòu)，引起雙鏈嵌入熒光染料SyberGreenⅠ的熒光顯著增強(qiáng)；但當(dāng)加入朊病毒

5、蛋白后，朊病毒蛋白與適配子的特異性相互作用促使T-Hg-T結(jié)構(gòu)打開(kāi)從而雙鏈結(jié)構(gòu)被破壞，SyberGreenⅠ的熒光降。當(dāng)朊蛋白濃度為13.0-156.0nmol/L時(shí)，SyberGreenⅠ的熒光強(qiáng)度與朊蛋白濃度呈現(xiàn)很好的線(xiàn)性關(guān)系，線(xiàn)性方程為IF-F0=58.33-8.42cPrP，相關(guān)系數(shù)R=0.992。
　　 3.雙適配子策略在多靶物分析中的應(yīng)用。與單適配子策略相比，雙適配子策略具有更高的選擇性和靈敏度，并能顯著提高分析方法

6、靈敏度。本研究將雙適配子策略應(yīng)用于多靶物分析中并選擇凝血酶、腺苷、朊病毒蛋白(PrP)三種與疾病相關(guān)的生物分子作為研究對(duì)象。結(jié)果表明，雙適配子策略能夠?qū)崿F(xiàn)同一樣品中凝血酶、腺嘌呤核苷酸和朊蛋白的同時(shí)檢測(cè)，且三種靶物的類(lèi)似物如鳥(niǎo)嘌呤核苷酸、胞嘧啶核苷酸、尿嘧啶核苷酸、IgG、蝸牛酶、牛血清白蛋白等對(duì)多靶物測(cè)定不產(chǎn)生干擾，顯示出雙適配子策略在多靶物分析中的高選擇性。
　　 4.雙適配子分子邏輯門(mén)在朊病毒蛋白構(gòu)象區(qū)分中的應(yīng)用。作為邏輯

7、門(mén)延伸的分子邏輯門(mén)以一個(gè)或多個(gè)復(fù)雜的生物或化學(xué)反應(yīng)過(guò)程為輸入信號(hào)，通過(guò)一定的邏輯運(yùn)算簡(jiǎn)化為單一輸出結(jié)果，例如疾病的診斷通過(guò)分子邏輯門(mén)可簡(jiǎn)化為“患病”或“正?！?。本文借助分子邏輯門(mén)的優(yōu)勢(shì)并將雙適配子策略應(yīng)用其中，成功構(gòu)建了能夠進(jìn)行“異或”(XOR)和“或”(OR)邏輯運(yùn)算的雙適配子分子邏輯門(mén)。結(jié)果表明，PrPC符合“異或”邏輯運(yùn)算而PrPRes符合“或”邏輯運(yùn)算。與傳統(tǒng)的朊病毒蛋白區(qū)分方法相比，本文所構(gòu)建的雙適配子分子邏輯門(mén)具有四個(gè)優(yōu)點(diǎn)：

8、(1)雙適配子分子邏輯門(mén)非常簡(jiǎn)單且能夠應(yīng)用于朊病毒蛋白不同構(gòu)象的區(qū)分；(2)使用雙適配子策略使得分子邏輯門(mén)具有極高選擇性，無(wú)需分離和純化即可實(shí)現(xiàn)血清中的朊病毒蛋白的區(qū)分；(3)雙適配子分子邏輯門(mén)的輸入信號(hào)(PrP和鹽酸胍)和元件(MMPs-Apt1和QDs-Apt2)的成本較低，且都是化學(xué)穩(wěn)定分子，而這是構(gòu)建更快、更高效、更小型的計(jì)算器所必需的；(4)因Apt1只在磁微米粒子表面形成單層而不涉及固定構(gòu)象，所以元件之一的MMPs-Apt1

9、能夠通過(guò)簡(jiǎn)單的方法進(jìn)行循環(huán)使用。
　　 5.肝素鈉誘導(dǎo)朊病毒蛋白構(gòu)象變化的光譜分析。粘多糖是一種在細(xì)胞膜表面和溶酶體中均有表達(dá)的朊蛋白配體分子，其在朊病毒病中發(fā)生中所發(fā)揮的作用目前仍存在爭(zhēng)議。本文以肝素鈉作為粘多糖的代表，通過(guò)共振光散射光譜、熒光光譜和圓二色光譜的變化研究了肝素鈉與人重組細(xì)胞型朊蛋白(rhPrPC23-231)的相互作用。結(jié)果表明，肝素鈉與朊蛋白相互作用后光散射和熒光信號(hào)均得到增強(qiáng)，且當(dāng)rhPrPC23-231濃

10、度為0.41-16.46μg/mL時(shí)，rhPrPC23-231濃度與共振散射光強(qiáng)度呈現(xiàn)很好的線(xiàn)性關(guān)系，線(xiàn)性方程：IRLS=183.84+272.40crhPrPC23-231，相關(guān)系數(shù)R=0.999。同時(shí)對(duì)朊蛋白和肝素鈉相互作用體系的熒光壽命表征表明，肝素鈉促使朊蛋白的熒光壽命有一定程度的延長(zhǎng)，而圓二色光譜的表征則表明肝素鈉能誘導(dǎo)朊蛋白從富含α-螺旋的構(gòu)象向富含β-折疊的構(gòu)象轉(zhuǎn)變。
　　 本研究基于配體所建立的一系列朊病毒蛋白分