SOCS3調(diào)控IL-6-JAK2-STAT3信號(hào)通路抑制主動(dòng)脈瓣間質(zhì)細(xì)胞成骨樣分化的機(jī)制研究.pdf

1、第一部分SOCS3調(diào)控IL-6/JAK2/STAT3信號(hào)通路抑制主動(dòng)脈瓣間質(zhì)細(xì)胞成骨樣分化
　　目的:鈣化性主動(dòng)脈瓣膜病(Calcified aortic valve disease，CAVD)已成為全球最常見心血管疾病之一。然而，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚。本研究通過調(diào)控人主動(dòng)脈瓣間質(zhì)細(xì)胞的SOCS3表達(dá)，探究其在LPS刺激下瓣膜間質(zhì)細(xì)胞成骨樣分化中的重要作用，并試圖研究證實(shí)JAK2/STAT3是否參與其發(fā)生及發(fā)展。
　　方法：使

2、用Western blots及 real-time PCR方法分別比較正常和鈣化主動(dòng)脈瓣膜來源的間質(zhì)細(xì)胞中SOCS3表達(dá)差異。構(gòu)建SOCS3表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染瓣膜間質(zhì)細(xì)胞后調(diào)控SOCS3表達(dá)水平。LPS刺激瓣膜間質(zhì)細(xì)胞檢測SOCS3表達(dá)，檢測間質(zhì)細(xì)胞成骨樣分化及成鈣能力，檢測間質(zhì)細(xì)胞分泌多種炎性細(xì)胞因子能力，檢測SCOS3對(duì)間質(zhì)細(xì)胞中STAT3磷酸化水平的影響。轉(zhuǎn)染SOCS3不同表達(dá)載體后，檢測瓣膜間質(zhì)細(xì)胞成骨樣分化的改變及其分泌炎性細(xì)胞因

3、子的改變。使用 IL-6中和抗體，拮抗IL-6生物學(xué)效應(yīng)后檢測SOCS3抑制瓣膜間質(zhì)細(xì)胞成骨樣分化的作用。使用JAK2/STAT3通路抑制劑AG490后檢測SOCS3抑制瓣膜間質(zhì)細(xì)胞成骨樣分化的作用。
　　結(jié)果:鈣化瓣膜間質(zhì)細(xì)胞中SOCS3表達(dá)增高。LPS刺激瓣膜間質(zhì)細(xì)胞后，瓣膜間質(zhì)細(xì)胞中 SOCS3表達(dá)上調(diào)，其成骨樣分化及成鈣能力均顯著增強(qiáng)，IL-6、IL-8和MCP-1分泌量顯著增高，此外LPS可上調(diào)瓣膜間質(zhì)細(xì)胞中STAT3磷

4、酸化水平。SOCS3抑制LPS刺激下瓣膜間質(zhì)細(xì)胞成骨樣分化及 IL-6和MCP-1表達(dá)。IL-6介導(dǎo)SOCS3的抑制作用，且SOCS3通過調(diào)控JAK2/STAT3通路發(fā)揮抑制間質(zhì)細(xì)胞成骨樣分化和抗炎作用。
　　結(jié)論：SOCS3通過抑制IL-6分泌和STAT3磷酸化水平進(jìn)而抑制主動(dòng)脈瓣間質(zhì)細(xì)胞在 LPS刺激下增強(qiáng)的成骨樣分化。IL-6在主動(dòng)脈瓣間質(zhì)細(xì)胞成骨樣分化中扮演關(guān)鍵角色。本研究結(jié)果將為未來鈣化性主動(dòng)脈瓣疾病的預(yù)防和分子靶向治療

5、提供新的研究方向。
　　第二部分IL-6誘導(dǎo)人主動(dòng)脈瓣間質(zhì)細(xì)胞成骨樣分化的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的 IL-6對(duì)人主動(dòng)脈瓣間質(zhì)細(xì)胞成骨樣分化及成鈣能力的影響。
　　方法選取主動(dòng)脈夾層(Debakey I型)患者行 Bentall+全主動(dòng)脈弓置換+支架象鼻術(shù)后正常主動(dòng)脈瓣膜，膠原酶消化法分離培養(yǎng)主動(dòng)脈瓣間質(zhì)細(xì)胞，穩(wěn)定傳代3-5代后的細(xì)胞納入實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為三組：對(duì)照組(培養(yǎng)基)，刺激組(10μg/ml IL-6)，中和組(10μg

6、/ml IL-6加10μg/ml anti-IL-6抗體).采用免疫熒光法檢測α-SMA及vimentin兩種標(biāo)志蛋白鑒定原代培養(yǎng)細(xì)胞表型；采用蛋白質(zhì)印記法(Western blots)檢測三組中成骨樣標(biāo)志蛋白堿性磷酸酶(ALP)及骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)-2的表達(dá)差異；利用茜素紅染色法，檢測比較三組中主動(dòng)脈瓣間質(zhì)細(xì)胞成鈣能力并進(jìn)行定量分析。
　　結(jié)果膠原酶消化法分離的細(xì)胞中，超過90％細(xì)胞表達(dá)α-SMA及vimentin蛋白。I

7、L-6干預(yù)后，刺激組主動(dòng)脈瓣間質(zhì)細(xì)胞中ALP及BMP-2表達(dá)均顯著增高（P<0.05 for both markers，n=3）；中和組中兩者的表達(dá)與對(duì)照組相比未見顯著差異(P>0.05，n=3)，而與刺激組相比兩者表達(dá)均顯著減低(P<0.05，n=3)。茜素紅染色結(jié)果顯示刺激組鈣結(jié)節(jié)數(shù)量明顯增多，而中和組中鈣結(jié)節(jié)數(shù)量跟刺激組相比則顯著減低。鈣沉淀定量分析進(jìn)一步確認(rèn)茜素紅染色結(jié)果(刺激組比對(duì)照組：83.33±9.71比7.33±4.16