陜西省太白尾礦區(qū)根瘤菌多樣性及苯酚降解研究.pdf

1、本論文綜述了根瘤菌多樣性、分類和多相分類技術(shù)的研究進(jìn)展；采用表型分析(153項(xiàng)生理生化測定，數(shù)值分類)和遺傳型分析(16SrDNAPCR-RFLP,23SrDNAPCR-RFLP,IGSPCR-RFLP,16SrRNA基因全序列分析)等多相分類技術(shù)，對分離自我國陜西省太白金礦尾礦廢棄地根瘤菌，首次系統(tǒng)進(jìn)行了多相分類和系統(tǒng)發(fā)育研究。 對陜西省太白金礦尾礦廢棄地根瘤菌進(jìn)行了豆科植物根瘤菌資源的調(diào)查和采集，涉及豆科植物7屬8種，分離純

2、化得到166株根瘤菌，斜面保存和甘油超低溫冰箱保藏，豐富了根瘤菌資源庫，為我國西部地區(qū)根瘤菌資源研究和開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。 以研究陜西省太白金礦尾礦區(qū)根瘤菌的資源多樣性和重金屬、苯酚抗逆性菌株的篩選為目的，選取分離自尾礦廢棄地及太白河邊的8種豆科植物的108株根瘤菌及42株參比菌株，進(jìn)行了生長溫度范圍，唯一碳源、氮源利用，生長初始pH，耐鹽性，重金屬和苯酚的抗性等151項(xiàng)表型性狀分析。結(jié)果表明，供試根瘤菌的表型特性存在明顯差異，在8

3、5％的相似水平上供試菌株聚成5個群，其中群1有26株菌，主要分離自天藍(lán)苜蓿(Medicagolupulina)；群2有12株菌，其寄主各不同；群3有3株菌，寄主均為金翼黃芪(Astragaluschrysopterus)；群4有40株菌，主要分離自金翼黃芪；群5有4株菌，寄主均為截葉鐵掃帚(Lespedezacuneata)。群Ⅳ與已知種R.mongolense聚在一起，其它4個類群未與參比菌株聚在一起，可能是新的表觀群，其分類地位需進(jìn)

4、一步確定。一些菌株表現(xiàn)了較強(qiáng)的抗重金屬和苯酚毒性的能力，其中1株菌能耐受0.15mmol/L的Hg2+，4株菌能耐受0.4mmol/L的Cu2+，3株菌能耐受1.6mmol/L的Zn2+，5株菌能耐受900mg/L的苯酚。 16SrDNAPCRRFLP聚類樹狀結(jié)果表明，所有菌株在大約85％的相似水平上根瘤菌聚成3個遺傳群，其中群1由包括2株快生根瘤菌參比菌株RhizobiumtropicitypeB和Rhizobiumindig

5、oferae在內(nèi)的34株菌組成，具有1種遺傳型，它們在數(shù)值分類中全部位于第4表觀群；群2的4株供試菌株在85％的水平上獨(dú)立成為1個新群，具有4種不同的遺傳型，它們在數(shù)值分類中并未聚在同一個群中；群3由7株供試菌株組成，具有同一遺傳型，但這7株供試菌株在數(shù)值分類中分別位于表觀群2和表觀群3中。綜合起來，分離自馬棘、金翼黃芪的44株供試菌株共產(chǎn)生了9種遺傳型。 23SrDNAPCRRFLP聚類樹狀圖中看出，所有供試菌株在大約83％的

6、相似水平上聚成2個遺傳群，其中群1包括37株菌，有11種遺傳型；群2包括7株供試菌株，有4種遺傳型。這44株供試菌株的聚類結(jié)果與數(shù)值分類結(jié)果以及16SrDNAPCRRFLP聚類結(jié)果相比較，存在一定的差異。綜合起來，分離自馬棘、金翼黃芪的44株供試菌株共產(chǎn)生了17種遺傳型。 IGSrDNAPCRRFLP聚類樹狀圖所示，所有供試菌株在80％相似水平上分成2個群，群1由42株供試菌株構(gòu)成，在90％的相似水平上分成2個亞群。亞群1由34

7、供試菌株組成，其在99％的水平上分為兩種遺傳型；亞群2由5株供試菌株組成，有2種遺傳型；群2組成一個獨(dú)立的新表觀群；群3由22參比菌株組成，在75％的相似水平上這些菌株分成了3個亞群。綜合起來，分離自馬棘、金翼黃芪的44株供試菌株共產(chǎn)生了14種遺傳型。 16S-23SrDNAPCRRFLP聚類樹狀圖所示，在大約83％的相似水平上供試菌株聚成2個遺傳群，這些結(jié)果與16SrDNAPCRRFLP聚類結(jié)果相當(dāng)吻合；群2的4株待測菌株在8

8、5％的水平上獨(dú)立成為1個新群，它們在數(shù)值分類并未聚在同一個群中。 在16SrDNA全序列系統(tǒng)發(fā)育樹中3個代表菌株分布于2個系統(tǒng)發(fā)育分支上，其中代表菌株CCNWTB64-1，CCNWTB66-1位于根瘤菌屬(Rhizobium)的分支，其與菌株R.sullaeIS123，R.gallicumR602，R.mongolenseUSDA1844，R.yanglingenseCCBAU71623，R.indigoferaeCCBAU71

9、042的序列同源性分別為98.3％，98.1％，98.0％，97.5％，97.3％；CCNWTB81-2位于Agrobacterium-Rhizobium交叉分支，其與參比菌株Ag.rubiIF013261的同源性最高為92.4％。代表菌株的16SrDNA序列分析結(jié)果與16SrDNAPCRRFLP的結(jié)果是一致的。研究發(fā)現(xiàn)，分離自同一區(qū)域的同種金翼黃芪植物的根瘤菌CCNWTB64-1，CCNWTB66-1和CCNWTB81-2位于不同的分

10、支，這表明與金翼黃芪共生的根瘤菌具有明顯的多樣性，也進(jìn)一步證明了在不同的地理、氣候條件下，與同一種宿主共生的根瘤菌可以是不同屬種的根瘤菌。 苯酚降解的動力學(xué)研究表明：當(dāng)苯酚濃度低于2998μM時，細(xì)胞生長不會受到苯酚的影響，相反，隨著濃度的升高而生長速率不斷加大。而當(dāng)苯酚濃度高于2998μM時，細(xì)胞生長受到苯酚抑制。從苯酚降解的最大速率可得出當(dāng)苯酚濃度低于3240μM時苯酚降解的速率呈現(xiàn)不斷增大的趨勢，而高于3240μM時，苯酚

11、降解的速率不斷降低。 多底物利用研究表明：對羥基苯甲酸，間苯三酚，肉桂酸，苯甲酸，苯酚等5種酚類化合物均可被CCNWTB70-1作為生長所必需的唯一碳源來利用，但是各種碳源之間存在差異性，其中以苯甲酸為最好，而間苯三酚為最差。 在以苯酚為底物的情況下，CCNWTB70-1菌株的鄰苯二酚1，2-雙加氧酶比活為1.3285units.mg-1，未測到鄰苯二酚2，3—雙加氧酶活性，表明CCNWTB70-1菌株降解這些芳烴化合物