感覺神經(jīng)肽受體拮抗劑對(duì)哮喘大鼠氣道平滑肌細(xì)胞作用的基礎(chǔ)研究.pdf

1、目的：
　　 哮喘是由于氣道暴露于各種抗原及化學(xué)刺激物所引起的慢性炎癥。慢性氣道炎癥及氣道高反應(yīng)性是哮喘的主要特征。目前對(duì)于哮喘的治療大多集中于抑制哮喘氣道炎癥及減輕氣道高反應(yīng)性。糖皮質(zhì)激素對(duì)于哮喘治療是一線類藥物,但是其不能完全控制哮喘,因此,對(duì)于哮喘發(fā)病機(jī)制的研究有利于探討哮喘治療的新途徑。目前對(duì)于哮喘發(fā)病機(jī)制的研究大多集中于免疫機(jī)制、氣道平滑肌及氣道上皮功能的研究。近幾年感覺神經(jīng)肽及其受體與哮喘關(guān)系的研究日益被引起關(guān)注。目

2、前認(rèn)為與哮喘關(guān)系較為密切的感覺神經(jīng)肽有P物質(zhì)(Substance P,SP)、神經(jīng)激肽A(Neurokinin A,NKA)、神經(jīng)激肽B(Neurokinin B,NKB),通過相應(yīng)的NK-1R、NK-2R、NK-3R發(fā)揮作用。尚云曉等在小兒哮喘臨床及哮喘動(dòng)物模型上研究證實(shí)哮喘患兒血漿及哮喘豚鼠血漿、氣管灌洗液、氣道組織中SP含量均顯著增加,哮喘豚鼠氣道組織中SPmRNA表達(dá)較正常豚鼠明顯上調(diào),均與病情呈正相關(guān)。但是對(duì)于感覺神經(jīng)肽受體在

3、哮喘氣道的表達(dá)及其受體拮抗劑對(duì)哮喘氣道作用的研究甚少。因此,本文通過制作哮喘大鼠模型以探討感覺神經(jīng)肽受體NK-1R在哮喘氣道的表達(dá)及其受體拮抗劑對(duì)哮喘氣道的影響,為哮喘的治療提供新的理論依據(jù)。
　　 氣道平滑肌細(xì)胞在哮喘氣道是一種重要的效應(yīng)細(xì)胞,其受氣道內(nèi)各種因素,尤其是各類免疫細(xì)胞所釋放的細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)的調(diào)節(jié),產(chǎn)生相應(yīng)的收縮反應(yīng),調(diào)節(jié)氣道的口徑,從而影響呼吸功能。在持續(xù)哮喘的病例中,ASMC在細(xì)胞外基質(zhì)、各種細(xì)胞因子、炎癥

4、因子和生長因子的作用下,ASMC會(huì)出現(xiàn)遷移性生長的現(xiàn)象。因此,氣道平滑肌細(xì)胞對(duì)于哮喘的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后起到重要的作用。感覺神經(jīng)肽P物質(zhì)有刺激氣道平滑肌細(xì)胞增殖、遷移的作用。但是對(duì)于P物質(zhì)受體拮抗劑對(duì)氣道平滑肌細(xì)胞增殖、遷移作用的研究甚少,因此,本試驗(yàn)通過對(duì)哮喘大鼠研究以探討感覺神經(jīng)肽P物質(zhì)及其受體在氣道平滑肌細(xì)胞表達(dá)分布的基礎(chǔ)上,通過P物質(zhì)受體拮抗劑干預(yù)原代培養(yǎng)大鼠氣道平滑肌細(xì)胞,以說明P物質(zhì)受體拮抗劑對(duì)氣道平滑肌細(xì)胞增殖、遷移的影響。

5、
　　 氣道平滑肌細(xì)胞的生物活性是通過細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的改變來完成的。氣道平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的改變與哮喘慢性氣道炎癥及氣道高反應(yīng)性密切相關(guān)。細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度是通過肌漿網(wǎng)鈣ATP-酶(SERCA)、IP3R及RyR離子通道來完成的。哮喘氣道平滑肌細(xì)胞SERCA2表達(dá)減少與細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增高有關(guān)。P物質(zhì)受體NK-1R屬G蛋白偶聯(lián)受體,SP與NK-1R結(jié)合后,通過G蛋白與磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)第二信使系統(tǒng)相聯(lián)系,并通過三磷

6、酸肌醇(IP3)作用于膜上的鈣離子通道,引起膜電位的去極化和蛋白激酶活性的改變,從而發(fā)揮其生物功能。目前,對(duì)于感覺神經(jīng)肽受體拮抗劑對(duì)于哮喘氣道平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣濃度及肌漿網(wǎng)鈣-ATP酶影響的研究甚少,因此,本實(shí)驗(yàn)通過熒光檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度成像系統(tǒng)及real-time PCR及westen-blot檢測(cè)SERCA2/IP3R表達(dá)以說明P物質(zhì)受體拈抗劑對(duì)氣道平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響。
　　 材料與方法：
　　 1、大鼠哮喘模型

7、的制作:
　　 按照Wistar大鼠哮喘模型制作哮喘模型,即第一天及第七天腹腔注射1％卵蛋白1mg、1％氫氧化鋁凝膠及6×109/ml百日咳滅活桿菌共1ml致敏,第15天開始霧化吸入1％卵蛋白誘喘7天。將45只Wistar大鼠隨機(jī)分成正常對(duì)照組、哮喘組、普米克令舒治療組。用卵蛋白霧化吸入制作哮喘大鼠模型。普米克令舒治療組吸入卵蛋白誘喘后給予普米克令舒吸入治療。
　　 2、標(biāo)本采集:
　　 造模第21天取材,每組大

8、鼠于末次激發(fā)24h內(nèi)腹腔注射1％戊巴比妥鈉麻醉,進(jìn)行左肺肺泡灌洗。右肺中葉置于4％多聚甲醛用于HE和免疫組化染色。剩余氣管及肺組織-80℃冰箱保存用于抽提總RNA、抽提蛋白。
　　 3、支氣管及肺組織病理學(xué)檢測(cè):免疫組化圖像分析檢測(cè)NK-1R表達(dá)組間差異。
　　 4、大鼠氣道平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng):用酶消化法原代培養(yǎng),差速貼壁法純化ASMC,第4代的ASMC用于實(shí)驗(yàn)。
　　 5、Real-time PCR檢測(cè)體外培養(yǎng)

9、純化的第4代細(xì)胞NK-1RmRNA表達(dá)差異。
　　 6、免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)氣道平滑肌細(xì)胞NK-1R表達(dá)。
　　 7、四甲基偶氮唑藍(lán)顯色法(MTT)檢測(cè)NK-1R拮抗劑對(duì)IL-13誘導(dǎo)氣道平滑肌細(xì)胞增殖的影響;流式細(xì)胞儀檢測(cè)ASMC細(xì)胞周期變化。
　　 8、Transwell小室檢測(cè)NK-1R拮抗劑對(duì)氣道平滑肌細(xì)胞遷移的影響。
　　 9、熒光檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度成像系統(tǒng)分析不同組氣道平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化及N

10、K-1R拮抗劑對(duì)哮喘氣道平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響。
　　 10、RT-PCR及Westen-blot檢測(cè)各組氣道平滑肌細(xì)胞SERCA2/IP3R表達(dá)差異。
　　 結(jié)果：
　　 1、OVA激發(fā)時(shí)可見到大鼠咳嗽、呼吸困難、喘息。哮喘組支氣管肺泡灌洗液(BALF)中白細(xì)胞計(jì)數(shù)及嗜酸粒細(xì)胞百分比較對(duì)照組大鼠明顯增加;ELISA檢測(cè)哮喘模型組大鼠血漿中IgE水平較正常組明顯增高,差異顯著(P＜0.05);HE染色提示哮

11、喘組大鼠肺組織中支氣管和血管周圍肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、支氣管上皮杯狀細(xì)胞均較正常大鼠肺組織中增加。哮喘組大鼠血漿IL-13水平較正常組明顯增高,差異顯著(P＜0.05);哮喘組大鼠血漿IFN-γ水平較正常組降低,差異顯著(P＜0.05);以上提示哮喘模型制作成功。
　　 2、免疫組化圖像分析NK-1R表達(dá)于氣道平滑肌細(xì)胞胞漿;普米克令舒治療組大鼠氣道NK-1R表達(dá)平均光密度值較哮喘組降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與正

12、常組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 3、Real-Time PCR檢測(cè)各組大鼠氣道平滑肌細(xì)胞NK-1RmRNA相對(duì)含量提示普米克令舒治療組氣道平滑肌細(xì)胞NK-1RmRNA表達(dá)明顯較哮喘組降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;但較正常對(duì)照組增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 4、NK-1R拮抗劑對(duì)IL-13介導(dǎo)的ASMC增殖有抑制作用,48及72 h組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 5、NK-1R拮抗劑對(duì)大

13、鼠氣道平滑肌細(xì)胞的遷移有抑制作用,24 h組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 6、哮喘大鼠氣道平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度較正常組增高;NK-1R拮抗劑干預(yù)組氣道平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度降低。
　　 7、Real-time PCR檢測(cè)NK-1R拮抗劑干預(yù)組哮喘氣道平滑肌細(xì)胞SERCA2表達(dá)較哮喘組增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);NK-1R拮抗劑干預(yù)組哮喘氣道平滑肌細(xì)胞IP3R表達(dá)較正常組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);哮喘組

14、ASMCSERCA2表達(dá)與正常組比較降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);哮喘組ASMC中IP3R表達(dá)與正常組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);NK-1R拮抗劑干預(yù)組哮喘氣道平滑肌細(xì)胞IP3R表達(dá)較哮喘組降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、NK-1R參與哮喘的發(fā)病機(jī)制。普米克令舒通過降低哮喘大鼠氣道內(nèi)NK-1R表達(dá)來參與抑制哮喘氣道神經(jīng)源性炎癥。
　　 2、NK-1R拮抗劑通過抑制