紅紫素對(duì)凝膠上磷酸化蛋白檢測(cè)優(yōu)化及專屬性的研究.pdf

1、目的:
　　1.研發(fā)一種操作便捷、靈敏度高、專屬性強(qiáng)的磷酸化蛋白檢測(cè)技術(shù);
　　2.為磷酸化蛋白的檢測(cè)提供染色方法，進(jìn)一步促進(jìn)該領(lǐng)域的發(fā)展。
　　方法:
　　1.以紅紫素為染料，聚丙烯酰胺凝膠為載體，對(duì)磷酸化蛋白進(jìn)行染色，通過(guò)篩選各種影響因素，包括染色液組成成分、染料濃度、染色時(shí)間等，探索各種影響因素的最佳條件，從而建立一種完整的紅紫素染色方法;2.使用一向凝膠電泳技術(shù)(1-D)，分別將標(biāo)準(zhǔn)蛋白、小鼠腦組織中提取

2、的總蛋白和人源成纖維細(xì)胞中提取的總蛋白進(jìn)行分離，并采用不同的磷酸化蛋白染色檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行分析，比較各種方法的靈敏度、磷酸化蛋白專屬性以及線性范圍等參數(shù);
　　3.使用二向凝膠電泳技術(shù)(2-D)，分別將小鼠腦組織中提取的總蛋白和人源成纖維細(xì)胞中提取的總蛋白進(jìn)行分離，并分別用紅紫素染色法和Pro-QDiamond染色法進(jìn)行染色分析，比較兩種方法的專屬性及與2-D的兼容性;4.使用Western Blot檢測(cè)技術(shù)和去磷酸化檢測(cè)技術(shù)，通過(guò)比

3、較紅紫素染色法與Pro-Q Diamond染色法的檢測(cè)結(jié)果，驗(yàn)證紅紫素染色法對(duì)磷酸化蛋白的專屬性。
　　5.使用生物質(zhì)譜分析技術(shù)，鑒定實(shí)際樣品中被檢測(cè)到的磷酸化蛋白，進(jìn)一步驗(yàn)證紅紫素染色法對(duì)磷酸化蛋白的專屬性。
　　結(jié)果:
　　1.以紅紫素-Al3+復(fù)合物為熒光探針，對(duì)影響檢測(cè)效果的各種因素進(jìn)行篩選，建定了一種在聚丙烯酰胺凝膠上的磷酸化蛋白染色檢測(cè)方法，具體步驟為:1)染色:將電泳后的聚丙烯酰胺凝膠放在盒子中，加入50

4、 mL染色液(3μM紅紫素，50μM Al3+，30％甲酰胺，40％甲醇，pH5.0的250 mMNaAc-HAc)，在50℃條件下，振搖50分鐘;
　　2)脫色:去除染色液，加入50 mL的脫色液(50％甲醇，pH4.0的500 mMNaAc-HAc)，室溫振搖1-3分鐘。
　　2.通過(guò)一向凝膠電泳技術(shù)，確定紅紫素染色法的檢測(cè)靈敏度為4-8 ng，優(yōu)于 Pro-Q Diamond染色法的8-16 ng;同時(shí)，紅紫素染色法對(duì)

5、磷酸化蛋白擁有較強(qiáng)的專屬性。
　　3.通過(guò)對(duì)小鼠腦蛋白和人源成纖維細(xì)胞蛋白的檢測(cè)與對(duì)比，說(shuō)明紅紫素染色法對(duì)實(shí)際樣品磷酸化蛋白的專屬性略優(yōu)于Pro-Q Diamond染色法。
　　4.通過(guò)二向凝膠電泳技術(shù)，明確紅紫素染色法無(wú)論對(duì)標(biāo)準(zhǔn)蛋白，還是對(duì)實(shí)際樣品中磷酸化蛋白的檢測(cè)，與2-D的兼容性跟Pro-Q Diamond染色法相似，并且重現(xiàn)性也比較好。
　　5.通過(guò)Western Blot技術(shù)，說(shuō)明紅紫素染色法對(duì)實(shí)際樣品中磷酸

6、化蛋白具有較強(qiáng)的專屬性，與Pro-Q Diamond染色法相當(dāng)，甚至優(yōu)于Pro-Q Diamond染色法。
　　6.通過(guò)去磷酸化檢測(cè)技術(shù)，說(shuō)明紅紫素染色法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)蛋白和實(shí)際樣品中磷酸化蛋白的專屬性與Pro-Q Diamond染色法相似。
　　7.通過(guò)生物質(zhì)譜技術(shù)，對(duì)紅紫素染色法檢識(shí)出的小鼠腦蛋白和人源成纖維細(xì)胞蛋白中的磷酸化蛋白進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)到的磷酸化蛋白個(gè)數(shù)分別為11個(gè)和12個(gè)，進(jìn)一步說(shuō)明紅紫素染色法對(duì)實(shí)際樣品具有較強(qiáng)的專屬