基于槲皮素-al3+復(fù)合物的磷酸化蛋白檢測(cè)技術(shù)的研究.pdf

1、目的:
　　1.開發(fā)操作方便、成本低廉、特異性強(qiáng)、靈敏度高的凝膠上磷酸化蛋白質(zhì)熒光檢測(cè)方法;
　　2.采用多種公認(rèn)的磷酸化蛋白檢測(cè)技術(shù)共同驗(yàn)證本方法在檢測(cè)磷酸化蛋白方面的特異性，以打破國(guó)外檢測(cè)技術(shù)的壟斷;
　　3.為磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究領(lǐng)域的發(fā)展提供合適的檢測(cè)技術(shù)。
　　方法:
　　1.利用槲皮素-Al3+復(fù)合物作為熒光探針初步建立檢測(cè)方法，之后考察各種影響檢測(cè)效果的因素，包括各步驟的組成成分及其濃度，最終

2、在聚丙烯酰胺凝膠上建立完整的磷酸化蛋白質(zhì)檢測(cè)方法。
　　2.采用一維凝膠電泳技術(shù)分別將標(biāo)準(zhǔn)白蛋(BSA和transferrin為非磷酸蛋白，作陰性對(duì)照;phosvitin，ovalbumin，α-casein和β-casein為磷酸化蛋白質(zhì)，作陽性對(duì)照)、小鼠各組織中提取的總蛋白以及去磷酸化處理前后的α-casein和β-casein進(jìn)行分離，將電泳后的蛋白凝膠用不同的磷酸化蛋白檢測(cè)技術(shù)分別進(jìn)行檢測(cè)分析，比較各個(gè)檢測(cè)技術(shù)的靈敏度、

3、磷酸化蛋白檢測(cè)特異性、線性范圍等各方面性質(zhì);
　　3.采用二維凝膠電泳技術(shù)對(duì)小鼠全腦蛋白進(jìn)行分離，將二維蛋白凝膠分別用槲皮素染色檢測(cè)方法和Pro-Q Diamond檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)分析，比較這兩種方法與二維凝膠電泳技術(shù)的兼容性;
　　4.與Western Blot檢測(cè)技術(shù)結(jié)果相互比較，以驗(yàn)證本方法檢測(cè)磷酸化蛋白的特異性;
　　5.采用生物質(zhì)譜技術(shù)對(duì)槲皮素-Al3+復(fù)合物檢測(cè)到的凝膠上磷酸化蛋白條帶進(jìn)行鑒定，進(jìn)一步驗(yàn)證本

4、方法檢測(cè)磷酸化蛋白質(zhì)的特異性。
　　結(jié)果:
　　1.采用槲皮素-Al3+復(fù)合物作為熒光探針，考察和篩選了各種影響因素，最終在聚丙烯酰胺凝膠上成功建立了一種新型的磷酸換蛋白檢測(cè)技術(shù)，具體操作步驟如下所示:
　　(1)固定:將電泳之后的蛋白凝膠放置于100 mL固定液中固定20分鐘，固定液組成:30％甲醇/10％乙酸;
　　(2)水洗:將凝膠放置于50 mL去離子水中洗滌2次，每次5分鐘;
　　(3)染色:將凝

5、膠放置于50 mL的染色液中染色60分鐘，染色液組成:25μM槲皮素，50μM Al3+，20％1，2-丙二醇，40％甲醇;
　　(4)脫色:將凝膠放置于50 mL脫色液中脫色3～5分鐘，脫色液組成:50％甲醇，250mM乙酸鈉，pH4.5（鹽酸調(diào)節(jié)pH）。
　　2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本方法檢測(cè)靈敏度達(dá)到了16-32 ng，優(yōu)于Stains-All檢測(cè)法，與Pro-Q Diamond檢測(cè)法相當(dāng);除此之外，本方法對(duì)磷酸化蛋白具有相

6、當(dāng)高的檢測(cè)特異性;
　　3.小鼠各個(gè)組織樣品總蛋白染色檢測(cè)結(jié)果顯示，槲皮素染色檢測(cè)法所檢測(cè)出的蛋白條帶與Pro-Q Diamond染色檢測(cè)法十分接近，說明本方法在檢測(cè)磷酸化蛋白質(zhì)方面具有非常良好的特異性，與Pro-Q Diamond染色檢測(cè)法相當(dāng);
　　4.根據(jù)磷酸化蛋白質(zhì)去磷酸化實(shí)驗(yàn)結(jié)果所示，去磷酸化后的磷酸化蛋白用本方法基本檢測(cè)不出來，而未去磷酸化的磷酸化蛋白質(zhì)則可以很好地被本方法檢測(cè)顯示，結(jié)果與Pro-Q Diamon

7、d染色檢測(cè)法相近，證明了本方法在檢測(cè)磷酸化蛋白質(zhì)方面具有良好的特異性;
　　5.根據(jù)二維凝膠電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果所示，本方法所檢測(cè)出的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)與Pro-QDiamond染色檢測(cè)法所檢測(cè)出的蛋白斑點(diǎn)十分相近，證明了本方法能夠與二維凝膠相互兼容和特異性;
　　6.根據(jù)Western Blot結(jié)果所示，本方法從小鼠大腦總蛋白中檢測(cè)出的蛋白條帶與Western Blot所檢測(cè)出的條帶十分接近，證明了本方法在檢測(cè)磷酸化蛋白質(zhì)方面具有非常良好