抗體對大腸桿菌氟苯尼考主動外排泵的影響及臨床耐藥菌株監(jiān)測方法的建立.pdf

1、自從抗菌藥在臨床上使用以來，就在人類和動物感染性疾病治療中起到了重要的作用。但是，隨著抗生素和化療藥物的發(fā)展以及在臨床上的廣泛應(yīng)用和濫用，尤其是獸醫(yī)臨床和飼料中的濫用，造成世界范圍內(nèi)耐藥菌株迅速增加，導(dǎo)致抗生素效力逐漸下降甚至對某些病原菌束手無策，給畜牧業(yè)發(fā)展和人類健康帶來了嚴(yán)重的潛在威脅。為了尋找解決臨床嚴(yán)重細(xì)菌耐藥問題的方法，我們針對動物專用新型廣譜抗生素氟本尼考，進(jìn)行深入的耐藥機(jī)制的研究。 本文將耐氟苯尼考的floR基因部

2、分基因片段插入pGEX-4T-2原核表達(dá)載體中，構(gòu)建以BL21(DE3)CodonPlus為宿主菌的原核表達(dá)體系。通過摸索IPTG的誘導(dǎo)濃度、誘導(dǎo)溫度和菌株收獲時間等條件，確定了floR1基因能在pGEX4T/BL21(DE3)codonplus中高效表達(dá)，且表達(dá)的重組蛋白為包涵體。采用超聲波裂解配以曲通-尿素對包涵體進(jìn)行洗滌的方法在pGEX表達(dá)系中取得了較好的效果。使用分步透析法對變性的包涵體進(jìn)行復(fù)性，將復(fù)性蛋白過GST親和層析柱得到

3、純化的GST-FloR1融合蛋白。并以GST-FloR1融合蛋白為抗原，成功制備出抗GST-FloR1融合蛋白的抗體。 為了進(jìn)一步闡明氟苯尼考的耐藥機(jī)制，本文通過列floR基因上游調(diào)控序列的分析，成功構(gòu)建了pGEM/floR及pBR322/floR質(zhì)粒，隨后轉(zhuǎn)入到了基因工程菌JM109中，兩株工程菌均顯示對氯霉素和氟苯尼考耐藥。 利用研究建立的測定氟苯尼考在細(xì)菌內(nèi)積聚的HPLC法測定了氟苯尼考在敏感和耐藥大腸桿菌內(nèi)的積聚

4、及抗體孵育后藥物在敏感和耐藥大腸桿菌內(nèi)的積聚。結(jié)果顯示耐氟苯尼考菌株比敏感菌株對氟苯尼考的積聚明顯降低，達(dá)到穩(wěn)態(tài)后，耐藥大腸桿菌對氟苯尼考的積聚約低于敏感大腸桿菌的3.5倍；與抗體孵育的耐藥菌，不管是實驗室構(gòu)建的基因工程菌還是臨床分離菌，藥物在菌體內(nèi)的蓄積量明顯增加，而對照敏感菌JM109，不管是否與抗體孵育，氟苯尼考在菌體內(nèi)的蓄積量沒有明顯變化，這說明抗體能提高耐藥細(xì)菌對藥物的敏感性。結(jié)果在國內(nèi)外首次初步證實了floR基因編碼的Flo

5、R蛋白在細(xì)胞膜上由質(zhì)子驅(qū)動力介導(dǎo)并通過主動外排泵貢獻(xiàn)細(xì)菌對氟苯尼考的耐藥性。 利用純化的抗血清建立了ELISA方法并進(jìn)行臨床氟苯尼考耐藥菌的監(jiān)測。在以多克隆抗體建立的ELISA方法中，用方陣滴定法確定包被抗原GST-FloR1的最適包被濃度為300ng/ml，抗血清的最高效價為1∶204800，抗血清純化后的最佳工作濃度為1∶6400，采用間接競爭ELISA法建立檢測FloR1的標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性檢測范圍為6.25ng/ml～200