差異表達(dá)小RNA及其下游靶基因與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系研究.pdf

1、本研究通過(guò)比較胃癌原發(fā)灶與配對(duì)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中小RNA表達(dá)譜，尋找差異表達(dá)小RNA，并檢測(cè)其在胃癌原發(fā)灶中的表達(dá)量，研究差異表達(dá)小RNA與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。最后通過(guò)生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)其靶基因，研究小RNA參與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的下游通路，旨在為胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移機(jī)制研究探尋潛在的靶基因。
　　一、激光捕獲顯微切割純化腫瘤與RNA質(zhì)檢體系的建立
　　目的：建立激光顯微切割純化腫瘤與微量RNA提取、質(zhì)檢的標(biāo)準(zhǔn)流程，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供質(zhì)量可

2、靠的RNA標(biāo)本。方法：使用紫外分光光度儀、瓊脂糖凝膠電泳、real-time PCR檢測(cè)不同離體時(shí)間正常胃粘膜中RNA降解的情況。選取5例胃癌原發(fā)灶及配對(duì)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶，使用激光捕獲顯微切割獲得純化腫瘤標(biāo)本，紫外分光光度儀、瓊脂糖凝膠電泳、Agilent2100生物分析儀檢測(cè)純化標(biāo)本的RNA質(zhì)量。結(jié)果：抽提自離體時(shí)間分別為0’，15’，30’，60’，120’，240’的胃正常粘膜中的總RNA未見(jiàn)明顯降解；miR-125b、U6、18S和

3、GAPDH在0’和240’兩組中的表達(dá)量無(wú)明顯差異。激光捕獲顯微切割8um厚切片10mm2能獲得606-1038ng的總RNA量，激光捕獲顯微切割標(biāo)本中存在總RNA降解。Agilent2100生物分析儀檢測(cè)見(jiàn)激光捕獲顯微切割標(biāo)本中總RNA降解，但小RNA水平未見(jiàn)明顯降解。結(jié)論：離體時(shí)間在240’內(nèi)的正常胃粘膜中總RNA無(wú)明顯降解；總RNA水平的降解并不指示小RNA水平的降解；激光捕獲顯微切割所獲總RNA質(zhì)與量滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。
　

4、　二、胃癌原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶間差異表達(dá)小RNA篩選及其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系分析
　　目的：尋找胃癌原發(fā)灶與配對(duì)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶間差異表達(dá)的小RNA，研究差異表達(dá)小RNA在胃癌組織標(biāo)本中的表達(dá)情況及其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。方法：使用小RNA芯片檢測(cè)5例胃癌原發(fā)灶與配對(duì)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶，尋找差異表達(dá)的小RNA。使用Stem-100p RT-PCR檢測(cè)33例胃癌患者術(shù)后標(biāo)本中差異表達(dá)小RNA的表達(dá)情況，并統(tǒng)計(jì)其表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。結(jié)果：小RN

5、A芯片共檢測(cè)到5個(gè)表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的小RNA，相對(duì)原發(fā)灶，miR-24-1*、miR-510、miR-1284在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中低表達(dá)，miR-10a、miR-1259在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中高表達(dá)。miR-10a、miR-24-1*、miR-510在33例胃癌原發(fā)灶中的表達(dá)量檢測(cè)顯示，miR-10a在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的原發(fā)灶中的表達(dá)量低于不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的(p=0.047)，但在伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的原發(fā)灶中，miR-10a表達(dá)量與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度無(wú)相關(guān)性。

6、結(jié)論：在胃癌原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中檢測(cè)到miR-10a、miR-24-1*、miR-510、miR-1259、miR-1284等5個(gè)差異表達(dá)小RNA，其中miR-10a在伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌原發(fā)灶中較不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的表達(dá)低，但其表達(dá)量與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度無(wú)相關(guān)性。
　　三、差異表達(dá)小RNA的靶基因預(yù)測(cè)與篩選
　　目的：預(yù)測(cè)差異表達(dá)小RNA的靶基因，研究小RNA參與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的下游通路，為后續(xù)研究小RNA調(diào)控的胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移通路

7、提供潛在分子目標(biāo)。方法：使用TargetScan預(yù)測(cè)miR-10a、miR-24-1*和miR-510的靶基因，檢索已發(fā)表的胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因譜或蛋白質(zhì)譜相關(guān)研究，對(duì)比優(yōu)化小RNA的靶基因預(yù)測(cè)。結(jié)果：使用TargetScan分別為miR-10a、miR-24-1*和miR-510預(yù)測(cè)到186個(gè)、438個(gè)和62個(gè)靶基因。結(jié)合已發(fā)表文獻(xiàn)，進(jìn)一步篩選得miR-10a靶基因CDK6、TPM4：miR-24-1*靶基因PURA；miR-510

8、靶基因EGR1。結(jié)論：經(jīng)生物信息學(xué)方法獲得miR-10a靶基因CDK6、TPM4；miR-24-1*靶基因PURA；miR-510靶基因EGR1。
　　四、小結(jié)
　　經(jīng)激光捕獲顯微切割獲得的RNA標(biāo)本質(zhì)與量均滿足后續(xù)小RNA研究的要求。小RNA芯片檢測(cè)到胃癌原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶間miR-10a、miR-24-1*、miR-510、miR-1259、miR-1284等5個(gè)差異表達(dá)小RNA，其中miR-10a在胃癌原發(fā)灶中的表達(dá)