反義TβRI及與反義TIMP-1聯(lián)合作用對實驗性肝纖維化的影響.pdf

1、背景與目的：肝纖維化是臨床各種慢性肝病的共同病理基礎和特征，肝臟細胞外基質(zhì)(ECM)的合成與降解失衡、導致ECM在肝內(nèi)的過度沉積是肝纖維化發(fā)展的主要機制。目前關于肝纖維化的研究已達成共識：肝纖維化是可逆性病變，而肝硬化則不可逆轉(zhuǎn)。因此阻止和延緩肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展是治療肝硬化的關鍵環(huán)節(jié)。 研究發(fā)現(xiàn)在致肝纖維化的細胞因子中最重要有血小板衍化生長因子(PDGF)和轉(zhuǎn)化生長因子β(transforminggrowthfactorβ，T

2、GF-β)，其中TGF-β是最強有力的致纖維化細胞因子。近幾年，肝纖維化中TGF-β的一般信號傳導通路已基本闡明：首先活化了的TGF-β與Ⅱ型TGF-β受體(TβRⅡ)結(jié)合并使之磷酸化而具有激酶活性；與TGF-β結(jié)合的TβRⅡ再結(jié)合Ⅰ型TGF-β受體(TβR)形成Ⅰ、Ⅱ型受體復合物，并使TβRⅠ磷酸化具有激酶活性；最后，激活的TβRⅠ激活酶磷酸化其特殊的受體Smads(R-Smads)，從而調(diào)節(jié)肝星形細胞(HSC)的轉(zhuǎn)化和ECM的合成、

3、降解。即TGF-β發(fā)揮作用必須借助其在細胞膜上的跨膜受體，TβRⅠ和TβRⅡ。故從理論上，可推測選擇性抑制TβRⅠ的表達，應可影響TGF-β信號傳導，從而抑制TGF-β的促纖維化作用。 在正常肝臟中，基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloprotei-nases，MMPs)與基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子(tissueinhibitorofmetallopropteinases，TIMPs)處于動態(tài)平衡的狀態(tài)，維持膠原的產(chǎn)生與降

4、解之間的平衡。當有損傷因子作用于肝臟，使HSC活化，打破了MMPs與TIMPs的平衡，就會導致膠原纖維降解的減少，致使大量的膠原在肝組織中沉積。肝內(nèi)主要存在的TIMPs有TIMP-1和TIMP-2，其中以TIMP-1表達更為顯著；主要存在的MMPs在人類為MMP-1，在嚙齒類動物為MMP-13；TIMP-1可與MMP-1/MMP-13特異性結(jié)合，抑制其活性。故推測，抑制TIMP-1的表達，可減輕TIMP-1對MMP-1/MMP-13的抑

5、制作用，增加ECM的降解，減少ECM的沉積，延緩肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展。我們應用重組DNA技術構(gòu)建反義TβRⅠ真核細胞表達質(zhì)粒和反義TIMP-1真核細胞表達質(zhì)粒，導入大鼠肝纖維化模型中。一方面，通過選擇性抑制TβRⅠ的表達，調(diào)節(jié)TGF-β信號傳導，從而抑制TGF-β的促纖維化作用；另一方面通過抑制TIMP-1的表達，減輕TIMP-1對MMP13的抑制作用，提高MMP13的活性，減少ECM的沉積，最終同時在兩個環(huán)節(jié)上干預肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展

6、。 材料和方法：1.反義質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定：取-80℃冰凍保存的大鼠肝組織，應用TRIzol法提取總RNA，15g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，并用紫外分光核酸蛋白分析儀測定RNA濃度和純度。使用一步法逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)試劑盒獲得目的基因TβRⅠcDNA片段，采用巢式PCR擴增TβRⅠ基因片斷。用Cacl2法誘導感受態(tài)細胞。將純化回收的pcDNA3.1(+)線性化載體和TβRⅠ基因片段定向及反向連接，構(gòu)建以p

7、cDNA3.1(+)為載體的反義TβRⅠ基因真核表達質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化JM109大腸桿菌。酶切證實的陽性克隆行測序分析。 2.大鼠肝纖維化模型制備及質(zhì)粒導入：有效進入實驗的大鼠90只。實驗大鼠隨機分為6組：反義TβRⅠ治療組(A組)、反義TβRⅠ+反義TIMP-1治療組(B組)、反義TIMP-1治療組(C組)、pcDNA3.1(+)空質(zhì)粒對照組(D組)、模型對照組(M組)、正常對照組(N組)。每組15只。采用四氯化碳復合法制備大鼠肝纖維

8、化模型，各治療組按組別將反義基因?qū)氪笫蟾卫w維化模型，每次100μg，每9天1次至第8周，共注射5次，最后一次注射與前一次注射隔4天，重組質(zhì)粒給予前按比例與Lipofectmine2000混勻靜置30min，經(jīng)腹腔導入體內(nèi)。實驗進入第8周時，各組隨機宰殺一只大鼠，確定模型對照組(M組)病理學診斷進入肝硬化階段后，在最后一次40％CCl4油溶液皮下注射后2天宰殺實驗動物。 3.結(jié)果觀察：應用蘇木素-伊紅染色、苦味酸-酸性品紅染色(

9、VG)觀察肝組織病理形態(tài)學變化，進行肝纖維化分級；應用免疫組化的方法觀察肝組織中TIMP-1，MMP13，及Ⅰ型膠原的表達，并應用計算機圖像分析技術半定量觀察其蛋白質(zhì)表達的強弱。實驗結(jié)果計量資料采用SPSS11.5軟件描述實驗數(shù)據(jù)特征，作Kruskal-Wallis法非參數(shù)檢驗(成組設計多樣本比較秩和檢驗及多樣本間兩兩比較秩和檢驗)，P＜0.05示差異有顯著性。等級資料病理形態(tài)學分級結(jié)果作Ridit分析。 結(jié)果：1.陽性克隆質(zhì)粒

10、經(jīng)雙酶切后行10g/L瓊脂糖凝膠電泳在DNAMarker430bp和線性化純化后pcDNA3.1(+)，5.3kb附近可見兩條明顯條帶，與所需目的片段大小相符，證實為陽性克隆，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。DNA測序結(jié)果與預期目的片段序列一致。 2.實驗中各組大鼠死亡率在正常范圍，肝纖維化模型組大鼠的肝組織病理分級為Ⅲ到Ⅳ級。 3.反義TβRⅠ治療組、反義TβRⅠ+反義TIMP-1治療組、反義TIMP-1治療組、pcDNA3.1(+

11、)空質(zhì)粒對照組、模型對照組、正常對照組各組Ⅰ型膠原的蛋白表達的IODSUM分別為：436512.7±130047.6、89654.0±31684.6、340427.7±90516.4、733917.7±168290.8、690236.1±161333.7、41329.7±21321.9；各組TβRⅠ的蛋白表達的IODSUM分別為：246898.1±86316.5、103553.5±77497.6、354982.±149408.8、568

12、166.8±132640.9、543148.6±175461.5、54348.7±40560.3；各組TIMP-1的蛋白表達的IODSUM分別為：110255.2±21894.1、29813.9±12478.3、65449.5±14894.7、197309.8±28484.7、204518.7±36030.7、6692.7±2688.3；各組MMP-13蛋白表達的IODSUM分別為：57489.9±17081.1、16112.3±104

13、81.3、65243.3±23352.1、112542.0±26735.0、5227.4±4224.0。與模型對照組、空質(zhì)粒組相比，各反義治療組的Ⅰ型膠原的沉積、TβRⅠ、TIMP-1、MMP13的蛋白表達均有所下降；模型對照組與空質(zhì)粒對照組之間Ⅰ型膠原的沉積、TβRⅠ、TIMP-1、MMP13的蛋白表達均無顯著差異；在正常對照組與各實驗組之間的病理學肝纖維化分級均存在顯著差異；各反義治療組的病理學肝纖維化分級較模型對照組，空質(zhì)粒對照組

14、均有明顯改善。模型對照組于空質(zhì)粒對照組之間病理學肝纖維化分級無顯著差異。 結(jié)論：1.成功構(gòu)建反義TβRⅠ/pcDNA3.1(+)真核細胞表達質(zhì)粒。 2.成功采用四氯化碳復合法制備大鼠肝纖維化模型。 3.反義TβRⅠ/pcDNA3.1(+)真核細胞表達質(zhì)粒及反義TIMP-1/pcDNA3.1(+)真核細胞表達質(zhì)粒均可改善實驗大鼠的病理學纖維化分級。 4.反義TβRⅠ/pcDNA3.1(+)真核細胞表達質(zhì)粒與

15、反義TIMP-1/pcDNA3.1(+)真核細胞表達質(zhì)粒聯(lián)合作用可進一步改善實驗大鼠的病理學纖維化分級。 5.反義TβRⅠ/pcDNA3.1(+)真核細胞表達質(zhì)粒，反義TIMP-1/pcDNA3.1(+)真核細胞表達質(zhì)粒均可抑制實驗大鼠肝組織中Ⅰ型膠原蛋白的沉積。 6.反義TβRⅠ/pcDNA3.1(+)真核細胞表達質(zhì)粒與反義TIMP-1/pcDNA3.1(+)真核細胞表達質(zhì)粒聯(lián)合作用可進一步抑制實驗大鼠肝組織中Ⅰ型膠原