保腎1號(hào)巴布劑治療慢性腎衰竭腎陽(yáng)虛證的機(jī)理研究.pdf

1、目的：
　　 在前期臨床研究的基礎(chǔ)上開(kāi)展實(shí)驗(yàn)研究：用CRF腎陽(yáng)虛證大鼠模型，從大鼠一般情況、腎功能、性激素、血液動(dòng)力學(xué)、腎性貧血、腎臟病理等方面，研究穴位敷貼治療CRF腎陽(yáng)虛證的作用機(jī)理；填補(bǔ)穴位敷貼治療腎病實(shí)驗(yàn)研究的空白。
　　 方法：
　　 研究對(duì)象：體重200±20g成年健康SD雄鼠共84只，隨機(jī)分7組?？瞻讓?duì)照組12只，另72只腺嘌呤灌胃制作慢性腎衰竭腎陽(yáng)虛證大鼠模型。模型對(duì)照組、尿毒清顆粒組、敷貼非穴位

2、組和綜合治療組A、B、C進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。
　　 (1).保腎1號(hào)巴布劑的制備：
　　 保腎1號(hào)巴布劑是按由附子、肉桂、細(xì)辛、丁香、花椒、穿山龍、生姜等組成按一定比例混合碾粉。經(jīng)工藝流程制成浸膏后，按一定比例加入事先配制的巴布劑基質(zhì)(主要成份明膠、甘油、聚丙烯酸鈉等)中，并加入0.5％的促滲劑——氮酮、一定比例的乳化劑及防腐劑等，充分溶合，均勻涂布于無(wú)紡布上，覆蓋聚乙烯薄膜，切成0.5cm×0.5cm的方塊，密封包裝，陰涼處

3、儲(chǔ)存?zhèn)溆?。每片巴布劑中的中藥含量，以臨床成人(按60Kg算)常用量，并按體表面積折算法換算：分別制成高劑量組(每片含中藥復(fù)方制劑6g)，中劑量組(每片含中藥復(fù)方制劑3g)，低劑量組(每片含中藥復(fù)方制劑1.5g)備用。由湖北省中醫(yī)院腎病科及藥劑科制備。
　　 (2).實(shí)驗(yàn)方法：
　　 造模：體重200±20g成年健康SD雄鼠共84只，空白對(duì)照組12只，另72只腺嘌呤灌胃制作慢性腎衰竭腎陽(yáng)虛證大鼠模型。按200mg/此·d劑

4、量將腺嘌呤制成混懸液1ml，定時(shí)給大鼠腺嘌呤灌胃喂藥，累計(jì)總劑量1.5g/只，造模全過(guò)程24d。第1～12d，每日給藥1次，第12d以后隔日給藥。于第25d剪尾取血，測(cè)BUN、Scr、UA、T，證實(shí)造模成功。
　　 分組：隨機(jī)分7組，空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、尿毒清顆粒組、敷貼非穴位組和綜合治療組A、B、C進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究?？瞻讓?duì)照組(12只)：僅予假敷貼法。模型對(duì)照組(12只)：造模+假敷貼法。尿毒清顆粒組(12只)：造模+尿毒清顆

5、粒治療。敷貼非穴位組(12只)：造模+尿毒清顆粒治療+敷貼非穴位法(使用低劑量敷貼給藥)。綜合治療組(36只)：造模+尿毒清顆粒治療+穴位敷貼法。綜合治療組A(12只)：使用高劑量敷貼給藥。綜合治療組B(12只)：使用中劑量敷貼給藥。綜合治療組C(12只)：使用低劑量敷貼給藥。
　　 上述治療療程均為30天。
　　 ①敷貼法：穴位敷貼法：參考文獻(xiàn)取大鼠命門(mén)、雙腎俞穴(考慮大鼠解剖結(jié)構(gòu)不適合做肢體穴位敷貼，故棄用復(fù)溜穴)，

6、用10％Na2S將敷貼組大鼠穴位及周邊皮膚脫毛3cm×5cm面積，并予保腎1號(hào)巴布劑敷貼于穴位處，面積約0.5cm×0.5cm，上面用大塊膠布固定。每次敷貼時(shí)間均達(dá)6～8h，每天敷貼1次，10天一個(gè)療程，三個(gè)療程共計(jì)30天。同時(shí)分別取高、中、低三個(gè)劑量的保腎1號(hào)巴布劑敷貼。
　　 ②假敷貼法：取穴與脫毛的步驟同上，僅使用基質(zhì)敷貼穴位，面積約0.5cm×0.5cm，上面用大塊膠布固定。每次敷貼時(shí)間均達(dá)6～8h，每天敷貼1次，連續(xù)敷

7、貼30天。
　　 ③敷貼非穴位法：取大鼠腹部皮膚，按上述辦法脫毛后，敷貼低劑量保腎1號(hào)巴布劑，面積約0.5cm×0.5cm，上面用大塊膠布固定。每次敷貼時(shí)間均達(dá)6～8h，每天敷貼1次，連續(xù)敷貼30天。
　　 注意：用大塊膠布將藥物或基質(zhì)敷貼固定于穴位處；敷貼期間將大鼠分開(kāi)飼養(yǎng)，防止大鼠互相撕咬導(dǎo)致膠布脫落；每次敷貼均達(dá)6h。
　　 ④尿毒清顆粒治療：按2g/kg·d劑量尿毒清顆粒制成混懸液1ml，定時(shí)給慢性腎衰竭

8、腎陽(yáng)虛證大鼠灌胃喂藥，從敷貼日第一天起，共30d。
　　 (3).標(biāo)本采集及處理：
　　 ①血漿：造模成功后并敷貼前、末次敷貼后當(dāng)天，應(yīng)用股靜脈插管取血法壩0量BUN、Scr、UA、T、RBC、HB、N0。
　　 ②腎組織：造模成功后并敷貼前、末次敷貼后當(dāng)天，每組隨機(jī)取2只，迅速處死摘除左腎，從腎皮質(zhì)向髓質(zhì)垂直取材，以戊二醛、多聚甲醛混合液作預(yù)固定，其后以1％四氧化餓固定，進(jìn)一步處理，用光鏡觀察。
　　

9、光鏡：在切片機(jī)下進(jìn)行3um切片，HE染色，觀察。
　　 (4).觀察檢測(cè)：
　　 ①日常觀察：包括大鼠的飲食、飲水、體重、大小便、皮毛、活動(dòng)情況、精神狀態(tài)等情況。重點(diǎn)觀察大鼠多尿，多飲，精神萎靡，食少，體重減輕，毛色干枯，耳廓蒼白，目色淡紅，瞇眼，眼瞼浮腫，尾巴濕冷，活動(dòng)度減少，豎毛，蜷縮，多尿，外陰周?chē)睗竦饶I陽(yáng)虛證表現(xiàn)。
　　 ②腎功能檢測(cè)：全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)檢測(cè)血清尿素氮(blood ureanitrog

10、en，BUN)、血肌酐(serum creat inine，Scr)、尿酸(ur ic acid，UA)。
　　 ③血漿睪酮(T)含量：采用酶標(biāo)免疫法檢測(cè)。取血1m1，肝素抗凝，離心出血漿，血漿睪酮(T)的測(cè)定方法按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。
　　 ④血液學(xué)指標(biāo)：全自動(dòng)血液分析儀檢測(cè)血紅細(xì)胞(RBC)、血紅蛋白(HB)。
　　 ⑤血液動(dòng)力學(xué)：血清一氧化氮(N0)采用硝酸還原酶法。
　　 血漿一氧化氮濃度檢測(cè)：

11、清晨空腹采血，取1mL置肝素抗凝管，1000r/min離心10min，分離后的血漿-70°保存，硝酸還原酶法測(cè)定血漿一氧化氮濃度。利用硝酸還原酶特異性將NO3-還原為NO2-，通過(guò)顯色深淺測(cè)定其濃度高低?？瞻坠苤屑尤腚p蒸水0.1mL，標(biāo)準(zhǔn)管中加入100μmo1/L標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液0.1mL，測(cè)定管加入標(biāo)本0.1mL，上述3管中均加入0.2mL試劑Ⅰ和0.2mL試劑Ⅱ，混勻，37℃準(zhǔn)確水浴60min。然后上述3管中均加入0.2mL試劑Ⅲ和0.1

12、mL試劑Ⅳ，充分旋渦混勻30s，室溫靜置10min，3500～4000r/min離心10min，取上清顯色。血漿一氧化氮含量=(測(cè)定管吸光度-空白管吸光度)/(標(biāo)準(zhǔn)管吸光度-空白管吸光度)×100μmo1/L。
　　 ⑥腎臟超微結(jié)構(gòu)：將留取的大鼠腎臟，從腎皮質(zhì)向髓質(zhì)垂直取材，立即以戊二醛、多聚甲醛混合液作預(yù)固定，其后以1％四氧化餓固定，進(jìn)一步處理，用光鏡觀察。
　　 光鏡：已固定的腎組織標(biāo)本，經(jīng)常規(guī)脫水，石蠟包埋，在切片

13、機(jī)下進(jìn)行3um切片，HE染色，觀察。
　　 結(jié)果：
　　 綜合治療A、B、C組可改善大鼠慢性腎功能衰竭的生存狀態(tài)和組織病理變化，且綜合治療A組較優(yōu)。綜合治療A、B、C組在治療前后腎功能對(duì)比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)，綜合治療A、B、C組在治療前后T、NO對(duì)比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。尿毒清組和非穴位敷貼組治療前后腎功能、T、NO對(duì)比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。綜合治療A、B、C組治療后與尿毒清組及非穴位敷貼組腎功