甘藍(lán)型油菜烷羥化酶基因BnMAH1-1、BnMAH1-2的克隆、表達(dá)分析與載體構(gòu)建.pdf

1、植物角質(zhì)層蠟質(zhì)是植物抵御外界環(huán)境脅迫的第一層屏障。MAH1基因是細(xì)胞色素P450中CYP96家族成員之一。在擬南芥中，MAH1被認(rèn)為編碼植物角質(zhì)層蠟質(zhì)脫羰基途徑中的烷羥化酶，催化烷烴羥基化形成次級(jí)醇和酮，而 MAH1在甘藍(lán)型油菜中的研究還未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)通過(guò)電子克隆與RT-PCR技術(shù)，分離獲得了兩個(gè)甘藍(lán)型油菜MAH1的全長(zhǎng)編碼區(qū)序列，分別命名為BnMAH1-1和BnMAH1-2，并進(jìn)行了相關(guān)生物信息學(xué)的分析與預(yù)測(cè)；通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量 PC

2、R技術(shù)檢測(cè)了這兩個(gè)成員的組織器官特異性表達(dá)特征，激素處理后的誘導(dǎo)表達(dá)模式，并通過(guò)比較這兩個(gè)基因成員在有蠟粉與無(wú)蠟粉材料中的表達(dá)差異初步探索了在蠟質(zhì)合成中的功能；同時(shí)，利用雙酶切技術(shù)構(gòu)建了BnMAH1-1的超表達(dá)載體和RNAi載體，為進(jìn)一步利用轉(zhuǎn)基因功能研究奠定基礎(chǔ)。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴利用甘藍(lán)型油菜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/203），以擬南芥MAH1基因序列為探針，

3、電子克隆得到2個(gè) ORF序列。通過(guò)PCR和RT-PCR方法從甘藍(lán)型油菜中克隆得到了這兩個(gè)ORF序列，分別命名為BnMAH1-1（基因登錄號(hào)：KT795344）和BnMAH1-2（基因登錄號(hào)：KT795345），其ORF長(zhǎng)度均為1491bp，無(wú)內(nèi)含子，G+C含量均為43.1％，二者的核苷酸序列一致性為92.4%，與擬南芥 MAH1基因一致性分別為85%和86.4%。二者在氨基酸水平上有90.9%的序列一致性和94.0%的相似性。NCBI

4、blastn與氨基酸序列多重比表明兩者與預(yù)測(cè)的甘藍(lán)的MAH1同源性最高，其次是白菜，然后是擬南芥 MAH1。通過(guò) P450親緣系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹(shù)表明，BnMAH1-1和BnMAH1-2與擬南芥MAH1/CYP96A15親緣關(guān)系最近。根據(jù)核苷酸預(yù)測(cè)的BnMAH1-1和 BnMAH1-2預(yù)前體蛋白均為496個(gè)氨基酸組成的多肽鏈，分子量（Mw）分別為57.06kDa和56.92kDa，等電點(diǎn)分別為8.76和8.33。預(yù)測(cè)的BnMAH1-1和 Bn

5、MAH1-2蛋白均為親水蛋白，存在信號(hào)肽序列。BnMAH1-1和 BnMAH1-2二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α螺旋（38.10%、40.12%）和無(wú)規(guī)則卷曲（35.28%、32.66%）構(gòu)成，而β轉(zhuǎn)角（8.27%、8.06）和延伸鏈（18.35%、19.15%）散布于整個(gè)蛋白質(zhì)中。三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明 BnMAH1-1和BnMAH1-2均是細(xì)胞色素 P450蛋白，并且含有一個(gè)保守的血紅素結(jié)合域F436xxGxRxCxG445。⑵實(shí)時(shí)熒光定量PCR以及半

6、定量結(jié)果分析表明，BnMAH1-1與BnMAH1-2基因在甘藍(lán)型油菜根、莖、葉、花、及角果中均有表達(dá)，其中在葉片中的表達(dá)量最高，其次是角果與莖，二者在根系中的表達(dá)量最低。這表明 BnMAH1-1和BnMAH1-2可能活躍地參與了甘藍(lán)型油菜地上部分、尤其是葉片角質(zhì)層蠟質(zhì)的沉積。對(duì)BnMAH1-1和BnMAH1-2在有蠟粉材料與無(wú)蠟粉材料中的差異表達(dá)分析結(jié)果表明，BnMAH1在有蠟粉材料莖、葉中的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于無(wú)蠟粉材料，BnMAH1-1和

7、 BnMAH1-2在無(wú)蠟粉材料葉片中幾乎不表達(dá)，表明蠟質(zhì)的減少與MAH1的轉(zhuǎn)錄下調(diào)有關(guān)。外源激素 MeJA誘導(dǎo)6h后，BnMAH1與 JA信號(hào)途徑標(biāo)志基因PDF1-2在渝油19中表達(dá)顯著上調(diào)，在中雙9中表達(dá)均下調(diào)。乙烯合成促進(jìn)劑 ACC顯著誘導(dǎo)了乙烯信號(hào)途徑標(biāo)志基因 ERF2的表達(dá)，BnMAH1在渝油19中表達(dá)無(wú)顯著變化，在中雙9中表達(dá)下調(diào)。SA處理6h后，SA信號(hào)途徑標(biāo)志基因PR1表達(dá)顯著上調(diào)，而B(niǎo)nMAH1在兩品種中表達(dá)均下調(diào)。⑶設(shè)

8、計(jì)了帶有 SacI/ XmaI酶切位點(diǎn)序列的PCR引物，從油菜總cDNA中擴(kuò)增獲得 BnMAH1-1的全長(zhǎng)編碼序列，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確后，利用 XmaI+SacI雙酶切技術(shù)將超表達(dá)序列最終克隆到pCambia2301G載體上，得到了攜帶目的基因的重組載體 pCambia2301G-BnMAH1-1，依次轉(zhuǎn)化大腸桿菌及根癌農(nóng)桿菌 LBA4404，獲得了攜帶BnMAH1-1的植物超表達(dá)載體的工程菌株。根據(jù)BnMAH1-1的保守區(qū)域設(shè)計(jì) RNAi

9、片段引物，利用 PCR克隆 RNAi片段，將其反義片段與正義片段采用NocI+AatII和BamHI+XbaI分別插入到植物RNAi基礎(chǔ)載體pFGC5941M的啟動(dòng)子與間隔區(qū)、間隔區(qū)與終止子之間，形成重組RNAi載體pFGC5941M-BMAH1-1I，PCR檢測(cè)表明載體構(gòu)建成功，并轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌獲得工程菌株。超表達(dá)載體與 RNAi載體的構(gòu)建為進(jìn)一步通過(guò)植物轉(zhuǎn)化進(jìn)行基因功能研究奠定基礎(chǔ)。⑷通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將甘藍(lán)型油菜烷羥化酶基因 Bn