JAK-STAT3對(duì)大鼠重癥急性胰腺炎血清體外作用AT-Ⅱ損傷的作用機(jī)制研究.pdf

1、研究背景和目的:重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)發(fā)病及其兇險(xiǎn),死亡率超過(guò)30％,在發(fā)病早期內(nèi)死亡者多由于急性胰腺炎相關(guān)肺損傷(acute pancreatitisassociated lung injury,APALI)(1,2)。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,目前研究顯示APALI是多因素共同作用下的病理生理過(guò)程,首先是胰酶的激活導(dǎo)致局部細(xì)胞因子(包括核因子)的活化,并使局部白細(xì)胞活化并釋放大量的細(xì)胞因子

2、和炎癥介質(zhì)損傷局部組織,其次,血漿細(xì)胞因子劇增擴(kuò)大炎癥反應(yīng),繼而導(dǎo)致遠(yuǎn)隔臟器白細(xì)胞聚集、激活,再通過(guò)白細(xì)胞的呼吸爆發(fā),釋放氧自由基損傷遠(yuǎn)隔臟器。細(xì)胞因子等炎癥介質(zhì)為其核心機(jī)制和直接因素。近年來(lái),隨著對(duì)不同刺激因素導(dǎo)致急性肺損傷的研究日益加深,發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)的激活主要是通過(guò)細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)的,并發(fā)現(xiàn)JAK激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)-轉(zhuǎn)錄活化因子3((Janus kinase/signal transducers and activators

3、of transcription,JAK/STAT3)通路是其中最為普遍、重要且共同的通路;當(dāng)JAK/STAT3磷酸化后,進(jìn)一步激活核因子和蛋白等,并啟動(dòng)和調(diào)控細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的基因轉(zhuǎn)錄,大多數(shù)細(xì)胞因子經(jīng)此通路將信號(hào)由細(xì)胞膜最終傳至胞核,以發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng),進(jìn)而啟動(dòng)一系列炎癥性病理過(guò)程(3,4)。鑒于這些研究結(jié)果高度提示此信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是炎癥反應(yīng)啟動(dòng)的“總開(kāi)關(guān)”,有效調(diào)節(jié)該關(guān)鍵的信號(hào)通路,便可在炎癥反應(yīng)的早期遏制其瀑布式放大,防止急性

4、肺損傷的發(fā)生。
　　 基于此,本實(shí)驗(yàn)中我們用胰腺被膜下注射5％牛黃膽酸鈉制作SD大鼠重癥急性胰腺炎模型,改良的體外培養(yǎng)法原代培養(yǎng)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞,用SAP大鼠血清體外作用AT-Ⅱ,并用JAK激酶抑制劑AG490預(yù)處理,采用EMSA法、RT-PCR法、Western blotting法分別檢測(cè)AT-ⅡSTAT3 DNA結(jié)合活性、mRNA和蛋白表達(dá),同時(shí)行AT-Ⅱ的SP-C、凋亡、Na+-K+-ATPase檢測(cè),探討JAK/STAT

5、3通路在重癥急性胰腺炎肺損傷發(fā)病過(guò)程中的作用,以期能為早期干預(yù)重癥急性胰腺炎肺損傷提供新的思路。
　　 研究方法:
　　 1.用胰腺被膜下注射5％牛黃膽酸鈉制作SD大鼠重癥急性胰腺炎模型;
　　 2.改良的體外培養(yǎng)法原代培養(yǎng)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞;
　　 3.實(shí)驗(yàn)分組:
　　 1)對(duì)照組:加入不含大鼠胰腺炎血清的DMEM培養(yǎng)液的正常AT-Ⅱ;
　　 2)SAP組:加入終濃度為10％大鼠胰腺炎血清

6、的DMEM培養(yǎng)液的正常AT-Ⅱ;
　　 3)SAP+AG490組:用AG490(JAK激酶抑制劑)(終濃度為10umol/L(5))預(yù)處理細(xì)胞6小時(shí)后,加入終濃度為10％大鼠胰腺炎血清。
　　 4.采用EMSA法、RT-PCR法、Westernblotting法分別檢測(cè)各組AT-Ⅱ的STAT3DNA結(jié)合活性、mRNA和蛋白表達(dá);
　　 5.采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)各組AT-Ⅱ的SP-C、凋亡檢測(cè),比色法檢測(cè)Na+-K

7、+-ATPase活性。
　　 結(jié)果
　　 1.SAP組24小時(shí)后胃腸管脹氣、壞死,大部分大鼠可見(jiàn)血性腹水、胸水,胰腺充血、水腫明顯,可見(jiàn)壞死灶,胰周有皂化斑;鏡下見(jiàn)胰腺組織間質(zhì)明顯水腫,葉間隔、小葉間隔甚至腺泡間隔距離增寬,血管擴(kuò)張充血,局部可見(jiàn)出血灶,散在多發(fā)的局灶性壞死,伴有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　 2.培養(yǎng)2d的AT-Ⅱ(AKP染色)胞漿中有較多分布不均,大小不一的藍(lán)色顆粒;培養(yǎng)5d的AT-Ⅱ(鞣酸染色)

8、可見(jiàn)不均勻地分布在核周的大小不一的褐色的嗜鋨小體(板層小體),細(xì)胞聚集成小島狀。
　　 3.大鼠重癥胰腺炎血清作用2h后,與對(duì)照組比,SAP組STAT3 DNA活性增強(qiáng);與SAP組比,SAP+AG490組STAT3 DNA活性減弱;與對(duì)照組(36.532)比,SAP組STAT3mRNA(46.824)表達(dá)增強(qiáng)(P＜0.01);與SAP組比,SAP+AG490組STAT3mRNA(21.116)表達(dá)減弱(P＜0.01);與對(duì)照組比

9、,SAP組STAT3蛋白表達(dá)增強(qiáng);與SAP組比,SAP+AG490組STAT3蛋白表達(dá)減弱。
　　 4.大鼠重癥胰腺炎血清作用4h后,與對(duì)照組比,SAP組SP-C蛋白表達(dá)下降(P＜0.01),與SAP組比,SAP+AG490組SP-C蛋白表達(dá)下降C(P＜0.01)。大鼠重癥胰腺炎血清作用2h后,與對(duì)照組比,SAP組AT-Ⅱ凋亡增加(P＜0.05);與SAP組比,SAP+AG490組AT-Ⅱ凋亡增加(P＜0.05)。大鼠重癥胰腺炎

10、血清作用2h、4h后,與對(duì)照組比,大鼠重癥胰腺炎血清作用2h、4h后SAP組Na+-K+-ATPase活性減弱(P＜0.05);與SAP組比,SAP+AG490組Na+-K+-ATPase活性減弱(P＜0.05)。
　　 結(jié)論
　　 1.胰腺被膜下注射牛黃膽酸鈉制作SD大鼠重癥急性胰腺炎模型制作成功,這種制模方法可靠,操作簡(jiǎn)單,重復(fù)性好,適于大量成批動(dòng)物模型制備,為探討SAP發(fā)病機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。
　　

11、2.改良的體外AT-Ⅱ細(xì)胞培養(yǎng)成功,其較改良前方法較簡(jiǎn)單,培養(yǎng)細(xì)胞濃度提高,為體外實(shí)驗(yàn)提供較好的細(xì)胞來(lái)源。
　　 3.JAK/STAT3通路在急性胰腺炎相關(guān)肺損傷中得到激活,其參與了急性胰腺炎相關(guān)肺損傷的發(fā)病的病理生理過(guò)程。JAK激酶抑制劑AG490在體外可有效抑制AT-Ⅱ中JAK/STAT3通路。
　　 4.在急性胰腺炎相關(guān)肺損傷的發(fā)病過(guò)程中,JAK/STAT3通路可能具有維持分泌SP-C、抑制細(xì)胞凋亡、維持鈉-鉀-A