酶聯(lián)免疫斑點試驗在脊柱結(jié)核輔助診斷中的應(yīng)用研究.pdf

1、研究背景：
　　 目前，結(jié)核病(tuberculosis，TB)仍然是當今世界嚴重危害人類健康的傳染性疾病之一，是單一致病菌所致的傳染性疾病中死亡率最高的疾病，同樣也是發(fā)展中國家的頭號傳染性殺手，是全球共同關(guān)注的一個嚴重公共衛(wèi)生問題。由于結(jié)核致病菌其復(fù)雜的生物學(xué)特性和全球不同地域的社會因素，加之近幾十年來各國對結(jié)核病防治策略的忽視，流動人口增多、多耐藥結(jié)核菌增多以及艾滋病的流行，使得結(jié)核病在全球范圍內(nèi)死灰復(fù)燃，流行逐漸加劇，大有

2、泛濫之勢，導(dǎo)致結(jié)核病疫情呈全球性的回升，這引起了國際社會廣泛的高度重視，世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）也將結(jié)核病作為重點控制的傳染病之一。據(jù)WHO的最新報告，2010年全球有大約880萬新發(fā)結(jié)核病例，145萬例死于該病。我國同樣是是全球TB高負擔(dān)國家之一，受不同地域人群居住狀況、社會經(jīng)濟發(fā)展水平、人群衛(wèi)生習(xí)慣及文化素質(zhì)等因素的影響，結(jié)核病發(fā)病率居高不下。目前我國結(jié)核病患者數(shù)量居全球第2位，同時

3、也是耐多藥TB患者數(shù)較多的國家之一。廣東省結(jié)核病防治任務(wù)面臨的形勢同樣非常嚴峻。目前，結(jié)核病人報告數(shù)始終位居全省甲乙類傳染病報告發(fā)病人數(shù)前列，根據(jù)相關(guān)耐藥性基線調(diào)查和2010年全省結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查，全省每年新發(fā)生菌陽肺結(jié)核病人估算在4.6萬例左右，其中耐多藥患者數(shù)約0.2萬例。肺結(jié)核報告發(fā)病人數(shù)中70％以上為農(nóng)民，且以男性青壯年為主。
　　 骨關(guān)節(jié)結(jié)核定義為結(jié)核分枝桿菌感染骨、關(guān)節(jié)、滑膜和脊柱所引起的疾患。其發(fā)病特點包括:

4、發(fā)病隱匿緩慢，病程長，合并癥多，常因骨骺和關(guān)節(jié)遭到結(jié)核分枝桿菌侵蝕，而影響其骨骼發(fā)育，嚴重者導(dǎo)致殘疾。骨關(guān)節(jié)結(jié)核是發(fā)病率最高的肺外結(jié)核部位，約占結(jié)核總發(fā)病率的3-5％，肺外結(jié)核發(fā)病率的35-50％以上。而脊柱結(jié)核占全身骨結(jié)核的首位，約占1/3以上，發(fā)病年齡以20～30歲的青年為高峰。脊柱結(jié)核的典型癥狀如腰背部僵硬、疼痛、脊柱局部叩擊痛，全身中毒癥狀，如盜汗、食欲不振、潮熱、乏力等;一旦出現(xiàn)脊柱后凸成角畸形、神經(jīng)功能（運動、感覺）障礙或竇

5、道形成已為脊柱結(jié)核后期改變。相對于這些晚期脊柱結(jié)核患者而言，目前需要關(guān)注的問題是隨著生活水平的提高及結(jié)核菌的變異，脊柱結(jié)核患者的癥狀往往不典型，起病隱匿，發(fā)病緩慢，早期臨床癥狀、影像學(xué)診斷不明顯。因此，如何在早期實現(xiàn)對脊柱結(jié)核的診斷，是所有脊柱外科醫(yī)生需要面對的問題與難題？
　　 眾所周知，脊柱結(jié)核如能早期診斷、早期治療，不僅可以制止病變發(fā)展、大大縮短療程、避免或減少畸形發(fā)生、而且可以保全功能、甚至可以不用手術(shù)而達到治愈的目的，

6、這樣也可以為國家和患者節(jié)約大量的醫(yī)療成本。文獻報道，非典型性脊柱結(jié)核發(fā)生率為2.1％～12.0％，當前脊柱結(jié)核延誤診治超過一年的病例約40％，脊柱結(jié)核誤診率為32.2％。細菌學(xué)檢查仍然是結(jié)核病確診的重要手段，是結(jié)核病診斷治療及評價治療效果最可靠的標準。結(jié)核病人的細菌學(xué)檢查，是發(fā)現(xiàn)傳染源的主要途徑和手段，是確定結(jié)核病診斷和化療方案的重要依據(jù)，也是考核療效，評價治療效果的可靠標準，在結(jié)核病防治工作中起著不可缺少的重要作用。但由于結(jié)核菌的遺傳

7、特性決定其生長周期長，致使常規(guī)細菌學(xué)檢查方法存在著靈敏度低、操作復(fù)雜，需時間較長和影響因素較多，不易標準化等原因，使細菌學(xué)診斷發(fā)展緩慢，無法充分滿足臨床診斷的需要。因此，發(fā)展敏感、早期、快速、簡便和預(yù)測預(yù)后的實驗室診斷技術(shù)是結(jié)核診斷的必要補充。如果能從免疫學(xué)的角度實現(xiàn)對脊柱結(jié)核患者的早期診斷并根據(jù)具體情況加以治療，可以大大縮短治療的療程，避免或減少畸形發(fā)生、而且可以保全功能、甚至可以不用手術(shù)而達到治愈的目的，為可能要接受脊柱結(jié)核手術(shù)治療

8、的患者節(jié)約大量費用，這樣也可以為國家和社會節(jié)約大量的醫(yī)療成本。
　　 近年來，一種應(yīng)用在結(jié)核感染診斷中的新技術(shù)——酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)(enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT)越來越得到許多學(xué)者與專家的關(guān)注。結(jié)核感染的免疫應(yīng)答反應(yīng)以細胞免疫為主。作為免疫應(yīng)答的一部分，T細胞受結(jié)核抗原刺激致敏，形成活化的效應(yīng)T細胞，這些T淋巴細胞在體外受到結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激后可分泌細胞因子γ干擾素(Int

9、erferon-γ，INF-γ）。ELISPOT技術(shù)即酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)，該技術(shù)起源于酶聯(lián)免疫吸附試驗，該技術(shù)利用體外特異性抗原刺激淋巴細胞后，檢測分泌特異性抗體細胞數(shù)量和功能，隨著技術(shù)發(fā)展用于檢測單細胞水平分泌特異性細胞因子的功能以及細胞數(shù)量。目前ELISPOT技術(shù)在肺結(jié)核的診斷應(yīng)用方面取得了良好的效果，但將其應(yīng)用于脊柱結(jié)核的相關(guān)應(yīng)用研究比較缺乏。
　　 目的：
　　 1.探討CFP-10/ESAT-6融合蛋白-ELIS

10、POT方法在脊柱結(jié)核輔助診斷中的應(yīng)用價值。
　　 2.探討T-SPOT.TB試劑盒在脊柱結(jié)核輔助診斷中的應(yīng)用價值。
　　 3.探討非典型性脊柱結(jié)核的臨床特點及T-SPOT.TB試驗對其診斷的應(yīng)用價值。
　　 4.探討ELISPOT試驗對脊柱結(jié)核手術(shù)前后療效的監(jiān)測作用。
　　 方法：
　　 1.CFP-10/ESAT-6融合蛋白-ELISPOT在脊柱結(jié)核輔助診斷中的應(yīng)用研究
　　 2011年

11、5月～2012年7月前瞻性納入南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院脊柱骨科和廣州市胸科醫(yī)骨科收治的可疑脊柱結(jié)核病例。自行設(shè)計受試者信息采集表，收集受試者基本臨床信息:性別、年齡、合并癥、影像學(xué)診斷、病理學(xué)結(jié)果、細菌學(xué)結(jié)果等，并對受試者出院進一步隨訪（≥6個月）。采集研究對象的外周血單核細胞進行CFP-10/ESAT-6融合蛋白-ELISPOT檢測，同時對所有納入者行結(jié)核菌素皮膚試驗(PPD)。結(jié)合最終臨床診斷和微生物學(xué)的診斷，應(yīng)用靈敏度、特異度、陽性預(yù)

12、測值和陰性預(yù)測值等指標來評價CFP-10/ESAT-6融合蛋白-ELISPOT在脊柱結(jié)核輔助診斷中的應(yīng)用價值，并且進一步探討CFP-10/ESAT-6融合蛋白-ELISPOT試驗結(jié)果與臨床因素的相關(guān)性。
　　 2.探討T-SPOT.TB試劑盒在脊柱結(jié)核輔助診斷中的應(yīng)用價值
　　 2011年5月～2012年8月前瞻性納入南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院脊柱骨科和廣州市胸科醫(yī)院骨科收治的可疑脊柱結(jié)核病例。自行設(shè)計調(diào)查量表收集受試者信息，

13、采集研究對象的外周血單核細胞同時行T-SPOT.TB試驗、CFP-10/ESAT-6融合蛋白-ELISPOT、Rv2041c-ELISPOT、Rv1419-ELISPOT和Rv0057-1352-ELISPOT檢測，將上述幾種抗原刺激ELISPOT試驗結(jié)果兩兩比較。結(jié)合最終臨床診斷和微生物學(xué)的診斷，應(yīng)用靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值等指標來評價T-SPOT.TB試驗在脊柱結(jié)核輔助診斷中的應(yīng)用價值，探討Rv2041c、Rv1419

14、和Rv0057-1352在ELISPOT上的應(yīng)用價值。
　　 3.探討非典型性脊柱結(jié)核的臨床特點及T-SPOT.TB對其診斷的應(yīng)用價值選取2011年3月～2012年9月南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院脊柱骨科、廣州市胸科醫(yī)骨科、廣東省中醫(yī)院骨科收治的非典型脊柱結(jié)核患者29例。由經(jīng)培訓(xùn)的脊柱外科醫(yī)生采用自行設(shè)計的非典型性脊柱結(jié)核信息采集表收集相關(guān)人口學(xué)信息、臨床特點（癥狀與體征）、實驗室數(shù)據(jù)及影像學(xué)檢查。分析非典型脊柱結(jié)核的臨床特征及影像學(xué)特

15、點。采集研究對象的外周血行T-SPOT.TB試驗，根據(jù)具體情況同時對所納入的研究對象行PPD試驗、抗酸桿菌涂片檢查、病灶病理學(xué)檢查和病灶結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)等，結(jié)合最終臨床診斷和微生物學(xué)的診斷，來評價T-SPOT.TB試驗在非典型性脊柱結(jié)核診斷中的應(yīng)用價值。
　　 4.探討ELISPOT試驗對脊柱結(jié)核手術(shù)前后的療效監(jiān)測作用
　　 連續(xù)選取2012年3月～2012年6月南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院脊柱骨科接受外科手術(shù)治療的脊柱結(jié)核患者

16、12例。自行設(shè)計調(diào)查量表收集受試者信息，分別在患者入院時、手術(shù)前2天和手術(shù)后2天采集受試患者的外周血行T-SPOT.TB試驗，觀察脊柱結(jié)核患者手術(shù)前后體內(nèi)效應(yīng)T細胞的反應(yīng)情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.CFP-10/ESAT-6融合蛋白-ELISPOT在脊柱結(jié)核輔助診斷中的應(yīng)用研究
　　 ①標本獲取及檢測情況
　　 在納入的102例患者中，有11例因未能完成ELISPOT試驗或者失訪被剔除出此項研究。其中

17、確診為脊柱結(jié)核組的有52例，確診為非脊柱結(jié)核疾病組的有39例。最終納入的91例患者均接受了CFP-10/ESAT-6融合蛋白-ELISPOT方法、PPD皮膚試驗和血清抗結(jié)核抗體檢測。52例脊柱結(jié)核患者中共有47例接受活檢穿刺病理檢測，42例患者行抗酸桿菌涂片檢查，40例患者行結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)。
　　 ②脊柱結(jié)核組和非脊柱結(jié)核疾病組ELISPOT形成SFC數(shù)量的比較
　　 CFP-10/EAST6融合抗原-ELISPOT形

18、成SFC數(shù)量在脊柱結(jié)核組和非脊柱結(jié)核疾病組間存在極顯著差異，CFP-10/EAST6融合抗原-ELISPOT在脊柱結(jié)核組形成SFC數(shù)量顯著高于非脊柱結(jié)核疾病組形成的SFC數(shù)量。
　　 ③ELISPOT方法與臨床常用診斷方法陽性率比較
　　 在整個研究過程中，PPD皮膚試驗的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為61.5％、46.2％、60.4％和47.4％;血清抗結(jié)核抗體試驗的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值

19、分別為55.8％、61.5％、65.9％和51.1％;CFP-10/EAST6融合抗原-ELISPOT試驗的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為82.7％、87.2％、89.6％和79.1％。脊柱結(jié)核組中，ELISPOT試驗總體陽性率高于PPD皮膚試驗和血清抗結(jié)核抗體試驗(P＜0.05)。
　　 ④脊柱結(jié)核組ELISPOT試驗與PPD皮膚試驗、抗結(jié)核抗體試驗和病理學(xué)檢查的配對比較
　　 經(jīng)過貯檢驗，CFP-10/

20、EAST6融合抗原-ELISPOT試驗檢測結(jié)果與PPD皮膚試驗結(jié)果比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，與血清抗結(jié)核抗體試驗結(jié)果比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，與病理學(xué)檢測結(jié)果比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。病理學(xué)檢查結(jié)果與ELISPOT試驗結(jié)果有著較好的一致性。
　　 ⑤脊柱結(jié)核組ELISPOT試驗與臨床特征的相關(guān)性
　　 研究顯示年齡、營養(yǎng)狀況與SFC數(shù)量及ELISPOT最終陽性率有著密切聯(lián)系。
　　 2.探

21、討T-SPOT.TB試劑盒在脊柱結(jié)核輔助診斷中的應(yīng)用價值
　　 ①研究對象及檢測標本情況
　　 在納入的70例患者中，有5例失訪被剔除出此項研究。其中確診為脊柱結(jié)核組的有34例，確診為非脊柱結(jié)核疾病組的有31例。
　　 ②T-SPOT.TB試劑盒與常規(guī)結(jié)核檢測方法的比較
　　 在整個研究過程中，PPD皮膚試驗的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為61.8％、58.1％、61.8％和58.1％;血清

22、抗結(jié)核抗體試驗的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為58.8％、70.9％、68.9％和61.1％;T-SPOT.TB試驗的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為85.3％、77.4％、80.6％和82.8％。脊柱結(jié)核組中，T-SPOT.TB試驗總體靈敏度高于PPD皮膚試驗和血清抗結(jié)核抗體試驗。
　　 ③脊柱結(jié)核組T-SPOT.TB試劑盒與PPD皮膚試驗、抗結(jié)核抗體試驗和病理學(xué)檢查的配對比較
　　 脊柱結(jié)核

23、組中，經(jīng)過x2檢驗，ELISPOT試驗檢測結(jié)果與PPD皮膚試驗結(jié)果比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，與血清抗結(jié)核抗體試驗結(jié)果比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，與病理學(xué)檢測結(jié)果比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。病理學(xué)檢查結(jié)果與T-SPOT.TB試驗結(jié)果有著較好的一致性（一致率:93.8％; Kappa值:0.714，P＜0.05）。
　　 ④Rv2041c-ELISPOT、Rv1419-ELISPOT和Rv0057-1352-EL

24、ISPOT技術(shù)檢測脊柱結(jié)核病人反應(yīng)情況與試驗條件的確定
　　 通過對10例脊柱結(jié)核患者的預(yù)實驗觀察，并與CFP-10/ESAT-6-ELISPOT的試驗結(jié)果相比，Rv1419-ELISPOT試驗的反應(yīng)情況較好，而Rv2041c-ELISPOT和Rv0057-1352-ELSPPOT的反應(yīng)較弱，在以上研究基礎(chǔ)上，選取2.0×105個細胞加入96孔培養(yǎng)板，孵育時間分別為20h，結(jié)果顯示20μg/ml和40μg/ml蛋白濃度斑點強度相

25、似，最終選取20μg/ml為Rv1419-ELISPOT的終濃度。
　　 ⑤脊柱結(jié)核組中不同抗原ELISPOT診斷靈敏度的比較
　　 CFP-10/ESAT-6-ELI SPOT的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值為:82.4％、83.9％、84.8％和71.9％。T-SPOT.TB試驗的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為:85.3％、77.4％、74.4％和80.8％，且兩種檢測結(jié)果有著較好的一致性。

26、r>　　 3.非典型性脊柱結(jié)核的臨床特點及T-SPOT.TB試驗對其診斷的應(yīng)用價值
　　 ①非典型性脊柱結(jié)核患者的臨床癥狀和體征
　　 從研究納入的29例非典型性脊柱結(jié)核患者臨床特點中，可以獲知腰背痛是最主要的臨床主訴（24例，82.8％）。
　　 ②非典型性脊柱結(jié)核患者的影像學(xué)特征
　　 29例患者主要的影像學(xué)特征為:(1)軟骨終板終板蟲蝕樣破壞:本組5例，在MRI上見椎體軟骨終板蟲蝕樣破壞，見于椎體

27、型或以椎體型為主的跳躍型脊柱結(jié)核;(2)單一椎體的中心性塌陷或者單一椎體輕度壓縮改變:本組5例;(3)多發(fā)性脊柱結(jié)核包括連續(xù)性和跳躍性脊柱結(jié)核:本組15例;(4)影像學(xué)局部破壞重，而臨床全身癥狀輕，即冷膿腫形成，但無明顯骨破壞:本組4例。
　　 ③T-SPOT.TB試驗與常規(guī)結(jié)核檢測方法的比較
　　 非典型性脊柱結(jié)核組中病灶抗酸桿菌涂片和結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)的陽性率分別為37.5％和78.3％。在整個研究過程中，PPD皮膚試

28、驗的陽性率為58.6％，血清抗結(jié)核抗體試驗的陽性率為62.1％，T-SPOT.TB試驗的陽性率為82.8％。
　　 4.ELISPOT試驗對脊柱結(jié)核手術(shù)前后療效監(jiān)測的作用
　　 ①患者基本情況分析
　　 本次研究共納入12例脊柱結(jié)核患者，其中有3例脊柱結(jié)核患者行單純結(jié)核病灶清除術(shù)，5例脊柱結(jié)核患者行一期前路病灶清除植骨融合內(nèi)固定術(shù)，4例脊柱結(jié)核患者行一期前路病灶清除椎間植骨并后路椎弓根螺釘系統(tǒng)固定術(shù)。
　　

29、 ②脊柱結(jié)核患者入院時，手術(shù)前后SFC數(shù)目的比較分析
　　 12例脊柱結(jié)核患者入院時，手術(shù)前后對應(yīng)ESAT-6的SFC平均數(shù)目分別為35.0±22.4、36.7±23.8、30.1±16.2;對應(yīng)CFP-10的SFC平均數(shù)目分別為55.1±68.5、57.4±68.3、44.1±47.9。經(jīng)過配對樣本t檢驗，患者入院時與手術(shù)前、手術(shù)前與手術(shù)后ESAT-6和CFP-10刺激形成的SFC數(shù)量比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。

30、r>　　 結(jié)論：
　　 1.以CFP-10/ESAT-6融合蛋白作為抗原的ELISPOT法應(yīng)用于脊柱結(jié)核診斷有著良好的靈敏度和特異度，能為脊柱結(jié)核感染患者提供有效的輔助診斷。
　　 2.T-SPOT.TB試驗在脊柱結(jié)核的診斷中有著較高的靈敏度（尤其是非典型性脊柱結(jié)核的診斷），可能成為脊柱結(jié)核感染早期診斷的一項重要的篩查工具，并輔助脊柱結(jié)核病的診斷。
　　 3.結(jié)核分枝桿菌Rv1419融合抗原具有較好的脊柱結(jié)核免