代謝組學(xué)方法評(píng)價(jià)慢性心力衰竭代謝重構(gòu)的基礎(chǔ)與臨床研究.pdf

1、慢性心力衰竭(CHF，chronic heart failure)是一組復(fù)雜的臨床綜合征，是各種病因?qū)е滦难芗膊〉膰?yán)重階段。隨著人口老齡化和醫(yī)療救治技術(shù)提高，心力衰竭患病率逐年增加，正在成為我國21世紀(jì)的重要公共衛(wèi)生問題。慢性心力衰竭是一種進(jìn)展性疾病，一旦發(fā)生即使去除病因，仍可通過心室重構(gòu)不斷發(fā)展。雖然近十余年來心衰的治療策略得到明顯改進(jìn)，但其預(yù)后仍然很差，5年病死率仍與惡性腫瘤相仿。因此研究心力衰竭的發(fā)病機(jī)制，探索新的治療靶點(diǎn)，成為

2、心力衰竭的主要研究方向。心力衰竭的心肌代謝重構(gòu)是近年來的研究熱點(diǎn)之一。所謂代謝重構(gòu)(metabolic remodeling)是指心力衰竭時(shí)，心肌細(xì)胞底物利用以及能量代謝紊亂的現(xiàn)象。研究表明在心衰發(fā)生發(fā)展的過程中，衰竭的心肌往往發(fā)生了能量代謝和底物利用的改變。這些代謝改變反映出衰竭心肌對(duì)能量需求增加，以及ATP合成利用能力受到了損害。大量臨床與實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明底物利用障礙和能量物質(zhì)缺乏可能是導(dǎo)致心肌重構(gòu)和慢性心衰進(jìn)展的重要原因，對(duì)心衰心臟進(jìn)

3、行代謝干預(yù)可改善心臟功能。然而如何檢測(cè)心肌能量代謝是心力衰竭代謝治療需要面臨的關(guān)鍵問題?，F(xiàn)有的檢測(cè)心肌代謝的方法主要是PET、MRI等影像學(xué)方法，但是這些方法操作復(fù)雜、設(shè)備昂貴，難以在臨床推廣應(yīng)用。我們已經(jīng)在前期的研究中建立了超聲心動(dòng)圖評(píng)價(jià)心肌能量消耗(MEE)的方法。本研究中我們擬通過代謝組學(xué)技術(shù)檢測(cè)心衰患者的血清代謝譜，分析其與超聲心肌能耗指標(biāo)MEE相關(guān)性，探討血清代謝組學(xué)方法評(píng)價(jià)心衰心肌代謝重構(gòu)的可行性。并在此基礎(chǔ)上篩選能夠客觀、

4、準(zhǔn)確反映心肌能量代謝的血清生物標(biāo)志物，從而建立一種實(shí)用、簡便、經(jīng)濟(jì)、有效的評(píng)價(jià)心臟能量代謝的血清學(xué)方法。并希望通過這樣一些標(biāo)志代謝物，探討心衰能量代謝障礙的發(fā)生機(jī)制，為發(fā)現(xiàn)新的心衰治療靶點(diǎn)提供線索。本研究共分三個(gè)部分:
　　 第一章：基于1H-NMR代謝組學(xué)方法在慢性心力衰竭中的應(yīng)用
　　 代謝是生命活動(dòng)的本質(zhì)和物質(zhì)基礎(chǔ)，任何生命運(yùn)動(dòng)均離不開代謝。當(dāng)機(jī)體受到外源性因素（如藥物、毒物等）或內(nèi)源性因素（代謝障礙、病理生理改變

5、）影響時(shí)，在細(xì)胞、組織，甚至整體水平會(huì)發(fā)生代謝的變化應(yīng)答，導(dǎo)致體液代謝物種類和濃度的變化。代謝組學(xué)通過檢測(cè)代謝物水平的整體和動(dòng)態(tài)變化，建立適當(dāng)?shù)姆诸惸Ｐ?，提取相關(guān)的生物代謝標(biāo)志物簇(biomarker clusters)，幫助明確診斷及了解疾病發(fā)病過程。我們?cè)诒菊轮欣么x組學(xué)方法，通過研究代謝物圖譜隨時(shí)間的變化，分析心力衰竭過程中整體功能的完整信息，驗(yàn)證這一技術(shù)方法在慢性心力衰竭中應(yīng)用的可行性。
　　 材料與方法:本研究共納入

6、研究對(duì)象61人。其中男性43人，女性18人，平均年齡61.5歲。其中正常對(duì)照組15人;心力衰竭組46人，其中NYHA心功能分級(jí)Ⅱ級(jí)者11例，Ⅲ級(jí)者18例，Ⅳ級(jí)者17例。采血前要求空腹8小時(shí)，1周內(nèi)未飲濃茶、咖啡等飲料。所采血液室溫下自然凝固1h，收集血清，4℃3000g離心10min，收集上層血清，置-80℃冷凍保存。檢測(cè)儀器采用美國瓦里安公司(Varian，Inc.)的INOVA600MHz超導(dǎo)核磁共振譜儀，配備脈沖場(chǎng)梯度，帶梯度場(chǎng)的

7、三共振探頭。檢測(cè)前將凍干處理過的血清樣本在室溫下解凍。向離心管中分別依次加入100μlTSP重水溶液(1mg/ml)，300μl血清以及200μl重水(D2O)，充分震蕩混勻后，13,000g離心10min。取550μl上清加入5mm核磁共振管中待用，當(dāng)樣本全部溶解呈勻質(zhì)透明時(shí)，分別采用馳豫編輯脈沖序列(CPMG)和擴(kuò)散編輯脈沖序列(LED)采集血清樣本的數(shù)據(jù)。對(duì)所得NMR數(shù)據(jù)經(jīng)傅立葉變換得到譜圖，然后調(diào)整相位并進(jìn)行基線校正。對(duì)CPMG

8、數(shù)據(jù)，將0.4～4.4范圍內(nèi)的譜按照每段0.01ppm進(jìn)行分段積分;對(duì)LED數(shù)據(jù)，將0～6.0范圍內(nèi)的譜按照每段0.04ppm進(jìn)行分段積分，并將4.6～5.0之間的譜排除。將積分按每張譜的總積分強(qiáng)度歸一化。所得數(shù)據(jù)輸出并轉(zhuǎn)換到Excel文件保存。我們采用SIMCA-P+軟件(v11.5，Umetrics，Ume(a),Sweden)進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。分析前先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行平均中心化和自動(dòng)標(biāo)度化處理。采用主成分分析法(PCA)建立判別模型。對(duì)

9、數(shù)據(jù)進(jìn)行正交信號(hào)校正處理（orthogonal signal correction，OSC）。然后采用偏最小二乘法(partial least square，PLS)進(jìn)行回歸分析。
　　 結(jié)果:1、對(duì)照組與心衰組典型血清1H-NMR圖譜顯示兩者血清代謝譜在δ0.84～0.90ppm，δ1.26～1.30ppm，δ1.32～1.33ppm,δ4.09～4.10ppm,δ2.22ppm,δ3.40～4.00ppm,δ1.19～1.2

10、0ppm和δ1.46～1.48ppm等多個(gè)化學(xué)位移的波峰大小有顯著差異。經(jīng)過譜峰歸屬后結(jié)果表明心衰組血清中的脂蛋白及糖基化合物的相對(duì)含量比對(duì)照組高，而丙氨酸等有機(jī)酸含量則較對(duì)照組低;2、PCA分析表明，對(duì)照組與EF＜40％心力衰竭組血清代謝組區(qū)別最為顯著，而另外兩組則不易區(qū)分;3、用OSC-PLS方法后上述3組兩兩間分離效果顯著改善;4、采用交叉驗(yàn)證和分類變量交換法進(jìn)行驗(yàn)證，上述方法建立的分類模型準(zhǔn)確度和預(yù)測(cè)度超過85％，模型穩(wěn)健可靠，

11、可以用來做進(jìn)一步分析;5、用變量重要性排序(variable importance in projection，VIP)值，載荷權(quán)重(loading weights)和相關(guān)系數(shù)（correlation coefficients）等方法篩選差異代謝物，結(jié)果基本一致。
　　 結(jié)論:1、正常對(duì)照組與EF＜40％心力衰竭組血清代謝組存在顯著差異，而40％＜EF＜50％心力衰竭組與正常組差別則不明顯;2、基于1H-NMR的技術(shù)結(jié)合正交信號(hào)

12、校正的PLS方法能夠識(shí)別各組之間血清代謝組差異，顯著改善分離效果;3、經(jīng)過多種驗(yàn)證方法證明，OPLS方法建立的分類模型準(zhǔn)確度和預(yù)測(cè)度均很高，模型穩(wěn)定可靠;4、不同方法篩選的差異代謝物基本一致。
　　 第二章：運(yùn)用代謝組學(xué)方法評(píng)價(jià)心肌代謝重構(gòu)及血清標(biāo)志物篩選
　　 我們?cè)诘谝徽轮幸呀?jīng)證明，利用基于1H-NMR的代謝組學(xué)方法能夠檢測(cè)出EF＜40％心力衰竭患者的血清代謝組相對(duì)于正常人已經(jīng)發(fā)生了顯著改變。在本章中，我們繼續(xù)利用1

13、H-NMR的代謝組學(xué)方法研究不同心肌能量消耗水平血清代謝組是否有差異。并以此為基礎(chǔ)篩選能夠代表心肌能量消耗的生物標(biāo)記物，為客觀定量評(píng)價(jià)心肌代謝重構(gòu)提供重要診斷工具，進(jìn)而為研究心衰發(fā)生發(fā)展的代謝機(jī)制提供線索。
　　 材料與方法:研究對(duì)象與血清代謝組學(xué)檢測(cè)方法同第一章。用我們前期已經(jīng)建立的超聲心動(dòng)圖方法測(cè)量入選者的心肌能量消耗(MEE)。以MEE為分類變量建立OPLS模型。
　　 結(jié)果:1、PCA顯示高M(jìn)EE組與低MEE組血

14、清代謝組之間區(qū)別顯著;2、建立關(guān)于MEE的PLS模型發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過正交信號(hào)校正后PLS模型分離效果最佳，模型準(zhǔn)確度和預(yù)測(cè)度均超過90％，驗(yàn)證結(jié)果表明模型穩(wěn)定可靠;3、以變量重要性排序(VIP)值為篩選標(biāo)準(zhǔn)，選取VIP值大于1的變量，共歸屬出18種代謝物。再進(jìn)一步用oneway-ANONA統(tǒng)計(jì)方法比較了各組代謝物水平差異，排除了三組間濃度無顯著差異的代謝物，篩選出了3-羥基丁酸（3-Hydroxybutyrate）、丙酮(Acetone)、琥

15、珀酸(Succinate)、纈氨酸(Valine)、丙氨酸(Alanine)、谷氨酰胺（Glutamine）、甲硫胺酸(Methionine)、肌酸(Creatine)等8種代謝物為血清標(biāo)志物;4、其中丙酮、3-羥基丁酸、琥珀酸與MEE呈正相關(guān)(r=0.451，0.452，0.508);谷氨酰胺、纈氨酸、丙氨酸、甲硫胺酸與MEE呈負(fù)相關(guān)(r=-0.257，-0.260，-0.475，-0.420)。篩選出的代謝物水平與患者是否使用ACE

16、I等藥物無關(guān)。與傳統(tǒng)心力衰竭危險(xiǎn)因素相關(guān)分析表明，丙酮、3-羥基丁酸、琥珀酸與腦鈉肽、肌酐、心率呈正相關(guān)(P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05);丙氨酸、甲硫氨酸與腦鈉肽(BNP)、心率則呈負(fù)相關(guān)(P＜0.01，P＜0.01)。甲硫氨酸與血糖呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)。年齡、體質(zhì)指數(shù)(BMI)、血清總膽固醇、甘油三酯以及尿酸與上述代謝物相關(guān)不明顯;5、受試者特征曲線(ROC)表明，腦鈉肽、丙酮、3-羥基丁酸、琥珀酸的AUC分別為0.9

17、8、0.92、0.90、0.86。丙酮診斷慢性心力衰竭，敏感度達(dá)89.13％，特異度達(dá)80％。3-羥基丁酸診斷敏感度達(dá)89.13％，特異度達(dá)93.33％。
　　 結(jié)論:1、不同MEE組的血清代謝組存在顯著差異，通過代謝組學(xué)方法可以有效進(jìn)行區(qū)分，其中以低MEE組和高M(jìn)EE組間區(qū)別最為顯著。2、篩選出與心肌能量消耗相關(guān)的8種代謝物，包括3-羥基丁酸(3-Hydroxybutyrate)、丙酮(Acetone)、琥珀酸(Succina

18、te)（以上呈正相關(guān)）;纈氨酸(Valine)、丙氨酸(Alanine)、谷氨酰胺（Glutamine）、甲硫胺酸(Methionine)（以上呈負(fù)相關(guān)）;中度MEE時(shí)升高，高M(jìn)EE時(shí)反而減少的代謝物，肌酸(Creatine);3.丙酮、3-羥基丁酸可作為慢性心力衰竭的小分子血清標(biāo)志物。
　　 第三章：基于GC/MS的大鼠心力衰竭模型血清代謝組學(xué)研究
　　 臨床上慢性心力衰竭病人個(gè)體差異比較大，加上很難完全去除飲食、情緒

19、等因素的干擾，容易使研究結(jié)果發(fā)生誤差。因此我們?cè)诘谌轮胁捎媚壳俺Ｓ玫墓跔顒?dòng)脈結(jié)扎法模擬缺血性心力衰竭發(fā)病過程，用基于GC/MS的技術(shù)方法，以進(jìn)一步研究心力衰竭大鼠與對(duì)照組血清代謝組學(xué)差異，為上述結(jié)果提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
　　 材料與方法:SPF級(jí)SD雄性大鼠51只，體質(zhì)量200-300g。隨機(jī)分為假手術(shù)組16只和冠狀動(dòng)脈結(jié)扎組35只。用冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法制備慢性缺血性心力衰竭模型。4周后，在麻醉狀態(tài)下，切開腹部，用真空取血管快速從下腔靜

20、脈抽取靜脈血。靜置10分鐘左右，離心后提取血漿，用于血清代謝組學(xué)分析。代謝組學(xué)檢測(cè)采用Agilent 7890A GC/5975C MS系統(tǒng)，毛細(xì)管色譜柱為Agilent J&W Scientific公司的HP-5MS(30m×250μmi.d.)。檢測(cè)前樣品管內(nèi)加入120μl色譜甲醇，離心取120μl上清液至高回收率樣品瓶中，溫和氮?dú)獯蹈?，加?0μl的15mg/ml甲氧胺吡啶溶液，然后加入80μlBSTFA試劑（含1％TMCS），7

21、0℃下反應(yīng)60分鐘后進(jìn)行GC/MS分析。采用全掃描形式進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，質(zhì)譜檢測(cè)范圍為50-600(m/z)。在R軟件平臺(tái)下采用自寫的程序代碼提取原始數(shù)據(jù)信號(hào)，然后導(dǎo)入TagFinder軟件進(jìn)行質(zhì)譜碎片的保留時(shí)間校正、峰對(duì)齊和反卷積分析，最后在EXCEL軟件中進(jìn)行后期編輯。數(shù)據(jù)導(dǎo)入Simca-P軟件（版本11.5）分別進(jìn)行主成分分析(PCA)、偏最小二乘方判別分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘方判別分析(OPLS-DA)。
　　

22、結(jié)果:1、假手術(shù)組16只，存活14只，總存活率87.5％。冠狀動(dòng)脈結(jié)扎組35只，存活18只，總存活率51.4％。手術(shù)組射血分?jǐn)?shù)（LVEF）顯著小于假手術(shù)組(47％vs76％，P=0.001)。2、PCA得分圖顯示，重度心衰組與輕度心衰組和對(duì)照組之間均有顯著差異，但是輕度心衰組與對(duì)照組之間無顯著差異。3、可以建立穩(wěn)定可靠的OPLS-DA模型，并篩選出44種差異代謝物。
　　 結(jié)論:1、重度心力衰竭的血清代謝組和正常相比發(fā)生顯著變化