腸系膜淋巴結固有exosome的制備及其對異體淋巴細胞增殖的影響.pdf

1、背景和目的:
　　近年來隨著新型免疫抑制劑的問世以及對移植免疫反應的進一步認識,急性排斥反應發(fā)生率明顯下降,但移植物半壽期和移植長期存活率提高并不明顯。慢性移植物功能損耗已經(jīng)成為阻礙移植器官長期存活的主要原因。因此如何調控機體內(nèi)在的免疫調節(jié)機制以重新建立長期免疫穩(wěn)態(tài)是減輕慢性移植物功能損害的關鍵,也是目前移植領域期待解決的關鍵問題之一。
　　淋巴結是構成免疫系統(tǒng)的不可或缺的組成部分,與脾臟、粘膜免疫相關組織共同構成外周免疫器

2、官。淋巴結中富含各種免疫細胞,共同參與了對淋巴液的濾過和凈化以及產(chǎn)生包括體液免疫和細胞免疫等免疫應答反應。腸系膜淋巴結(MLN)是位于腸道系膜區(qū)的淋巴結,是局部腸相關淋巴組織(GALT)的重要組成部分,除去上述淋巴結共同的作用之外,腸系膜淋巴結還參與了誘導口服免疫耐受、協(xié)助腸道上皮內(nèi)淋巴細胞下調腸道免疫應答等作用?？诜褪苁侵附?jīng)口服途徑給予機體異體蛋白抗原,經(jīng)過一系列復雜的自身調節(jié)進而形成免疫系統(tǒng)對該抗原產(chǎn)生特異性免疫無應答或者低應答的

3、狀態(tài)。故腸系膜淋巴結在維持腸道對必須接觸的異體抗原(食物抗原、共生菌抗原)產(chǎn)生免疫無應答或低應答狀態(tài)起到了至關重要的作用。人體對于免疫系統(tǒng)的調節(jié)一直是多通路多因子的復雜調節(jié)網(wǎng)絡,而不是只依賴某一條信號通路或者某一種細胞分泌的單一細胞因子的作用,故腸系膜淋巴結必須作為一個結構和功能整體才能發(fā)揮出復雜的免疫調節(jié)功能。
　　exosome是活細胞晚期核內(nèi)體以胞吐的形式分泌到胞外形成,最早在研究紅細胞時被發(fā)現(xiàn),由于其結構和功能的特點使ex

4、osome已經(jīng)成為一種新型細胞間信號傳導方式,且不同細胞來源的exosome因其攜帶的蛋白組成不同而具有各異的功能,如DC分泌的exosome和B細胞分泌的exosome富含共刺激分子(CD86、CD80)和MHCII分子,是T細胞活化的必需刺激因子;人類鼻咽癌來源的exosome含有l(wèi)atent membrane protein gene 1(LMP1),具有抑制T細胞活化效應;某些腫瘤細胞分泌的exosome能異常地表達Faslig

5、and(FasL),介導活化的細胞死亡(activated induced cell death,AICD)?，F(xiàn)已證實T細胞,B細胞,樹突狀細胞,肥大細胞,上皮細胞以及多種腫瘤細胞等均能分泌exosome。那么作為結構和功能整體的腸系膜淋巴結是否也存在組織固有exosome,并通過其進行遠端調控?為證實這一設想,我們通過提取腸系膜淋巴結組織固有exosome并檢驗其生物學組成以及對淋巴細胞增殖的影響。
　　材料和方法:
　　

6、本實驗旨比較三種exosome提取方法的優(yōu)劣以找出最適用于腸系膜淋巴結源性exosome的制備方法,通過此方法完成對腸系膜淋巴結固有exosome的提取,并檢測此exosome樣本的生物學組成及其對淋巴細胞增殖的影響:
　　(1)運用超濾密度梯度離心法、ExoQuick Precipitation提取法、差速離心法對T細胞源性exosome進行提取;
　　(2)通過電鏡觀測,操作耗時分析,蛋白定量分析比較得出最優(yōu)提取方法;<

7、br>　　(3)通過此法對腸系膜淋巴結與外周淋巴結組織固有exosome進行提取;
　　(4)對所得exosome通過電鏡觀測,蛋白定量,SDS-PAGE電泳檢測比較,并通過HPLC-CHIP-MS/MS蛋白質譜技術檢測腸系膜淋巴結固有exosome蛋白組成;
　　(5)最后以混合淋巴細胞培為平臺觀察其體外生物學功能,Western-Blot檢測特定細胞因子的表達。
　　結果:
　　1、超濾密度梯度離心、ExoQ

8、uick Precipitation提取法、差速離心法均能夠正確的提取T細胞源性exosome;所制備的樣本呈類圓形囊泡,囊泡外周可見其膜性結構,直徑分布于30-100nm之間,可以單個分布,也可聚集成群,即為exosome。
　　2、超濾密度提取離心法能夠在經(jīng)濟省時的基礎上獲得無蛋白丟失的exosome樣本;ExoQuick Precipitation提取法提取耗時長、提取成本高;差速離心法提取過程造成了exosome蛋白丟失;

9、
　　3、使用超濾密度梯度離心法成功的制備了腸系膜淋巴和外周淋巴結結組織源性exosome,電鏡下可見其為30-100nm均勻圓形小體,形態(tài)顯著;
　　4、蛋白定量和SDS-PAGE電泳顯示腸系膜淋巴結與外周淋巴結源性exosome所含蛋白在數(shù)量和相對分子質量上均存在差異;
　　5、對腸系膜淋巴結源性exosome行蛋白質譜分析,證實其蛋白含量豐富,包括:Cap1 Adenylyl cyclase-associated

10、 protein 1、Ldha L-lactate dehydrogenase A chain、Csif Cytokine synthesis inhibitory factor、Hspa8 Heat shock cognate 70 kDa protein8等蛋白;
　　6、體外混合淋巴細胞培養(yǎng)顯示對照組、MLN組、PLN組在OD450處光密度值分別為0.270±0.009、0.191±0.002、0.396±0.023,腸系膜

11、淋巴結源性exosome能抑制淋巴細胞的增殖(P<0.05),外周淋巴結源性exosome具有促進淋巴細胞增殖的作用(P<0.05);兩種淋巴結固有exosome中均有IL-10的表達,且腸系膜淋巴結固有exosome中IL-10的表達強度要高于外周淋巴結固有exosome。
　　結論:
　　1、超濾密度梯度離心法能夠在經(jīng)濟省時的基礎上獲得無蛋白丟失的exosome樣本,是一種較為理想的exosome制備方法;
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