納米細(xì)菌對(duì)人膽囊結(jié)石形成的影響和機(jī)制探討.pdf

1、第一章納米細(xì)菌與大腸桿菌在膽囊結(jié)石患者體內(nèi)的共生關(guān)系 目的：通過對(duì)膽囊結(jié)石中納米細(xì)菌和大腸桿菌的分別培養(yǎng)與鑒定，以及對(duì)兩菌混合培養(yǎng)后在不同培養(yǎng)條件下的生長狀況，菌液涂片的茜素紅鈣染色情況的分析，及培養(yǎng)上清中的β-葡萄糖醛酸酶的定量分析，以期發(fā)現(xiàn)納米細(xì)菌和大腸桿菌在膽囊患者體內(nèi)共同存在、相互作用、協(xié)同促進(jìn)結(jié)石形成的證據(jù)。 方法：取45例膽囊結(jié)石患者的結(jié)石標(biāo)本，每例標(biāo)本分成兩份，任取一份結(jié)石標(biāo)本進(jìn)行納米細(xì)菌培養(yǎng)，光鏡觀察納米

2、細(xì)菌的生長情況，并對(duì)培養(yǎng)物采用納米細(xì)菌單克隆抗體免疫熒光染色、茜素紅鈣染色、及電鏡下尋找納米細(xì)菌的形態(tài)學(xué)證據(jù)，判斷納米細(xì)菌在標(biāo)本中感染狀況；取另一份膽囊結(jié)石患者的結(jié)石標(biāo)本，進(jìn)行大腸桿菌的培養(yǎng)與鑒定，判斷大腸桿菌在標(biāo)本中的感染狀況；計(jì)算45例膽囊結(jié)石患者的結(jié)石標(biāo)本中納米細(xì)菌和大腸桿菌的感染率，并對(duì)其進(jìn)行Kappa-致性檢驗(yàn)，尋找兩者在膽囊結(jié)石形成過程中共生關(guān)系的證據(jù)；進(jìn)行納米細(xì)菌和大腸桿菌混合培養(yǎng)，對(duì)培養(yǎng)物采用茜素紅鈣染色及β-葡萄糖醛酸

3、酶的測定，探討納米細(xì)菌與大腸桿菌的相互作用以及其機(jī)制。 結(jié)果：對(duì)45例結(jié)石標(biāo)本的培養(yǎng)物進(jìn)行免疫熒光染色，顯微鏡觀察其中有18例感染納米細(xì)菌，陽性率為40％；采用茜素紅鈣染色，發(fā)現(xiàn)其中有21例感染納米細(xì)菌，陽性率為46.7％。膽囊結(jié)石患者的45例結(jié)石標(biāo)本中有24例感染大腸桿菌，陽性率為53.3％。膽囊結(jié)石患者的45例結(jié)石標(biāo)本中有16例的培養(yǎng)物，納米細(xì)菌和大腸桿菌檢測都為陽性，Kappa一致性檢驗(yàn)說明兩者共感染一致率高(P<0.01

4、)。納米細(xì)菌與大腸桿菌混合培養(yǎng)后，培養(yǎng)瓶中出現(xiàn)白色鈣化樣物質(zhì)，菌液在瓊脂板上傳代培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)混合培養(yǎng)菌落周圍有白色粉末顆粒，混合培養(yǎng)菌液涂片發(fā)現(xiàn)部分大腸桿菌茜素紅鈣染色呈陽性(30％±2％)，高于大腸桿菌單獨(dú)培養(yǎng)組(P<0.01)；納米細(xì)菌與大腸桿菌混合培養(yǎng)后檢測未發(fā)現(xiàn)大腸桿菌的β-葡萄糖醛酸酶分泌增加(P>0.05)。 結(jié)論：膽囊結(jié)石患者的結(jié)石中存在著納米細(xì)菌感染；膽囊結(jié)石患者的結(jié)石中存在著大腸桿菌感染；納米細(xì)菌與大腸桿菌在膽囊

5、結(jié)石中的共感染一致率高，可能共同參與膽囊結(jié)石的形成；免疫熒光試驗(yàn)和透射電鏡可以幫助鑒定納米細(xì)菌；短時(shí)間的混合培養(yǎng)后，納米細(xì)菌通過直接附著和侵入大腸桿菌的方式引起大腸桿菌發(fā)生生物礦化作用；尚沒有證據(jù)支持納米細(xì)菌是通過促進(jìn)大腸桿菌產(chǎn)生β-葡萄糖醛酸酶這條途徑增強(qiáng)其促成石能力。 第二章納米細(xì)菌對(duì)人膽囊上皮細(xì)胞的侵襲作用 目的：在成功分離、培養(yǎng)人膽囊上皮細(xì)胞的基礎(chǔ)上，研究納米細(xì)菌對(duì)人膽囊上皮細(xì)胞的侵襲作用。 方法：尋找適

6、宜的方法和合適的體外生長條件，行體外分離、培養(yǎng)及鑒定人膽囊上皮細(xì)胞。然后將實(shí)驗(yàn)分為兩組，第一組將納米細(xì)菌菌株Se90和人膽囊上皮細(xì)胞爬片混合培養(yǎng)，第二組為膽囊上皮細(xì)胞爬片空白對(duì)照組。光鏡下觀察不同濃度納米細(xì)菌攻擊后人膽囊上皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化；使用四唑鹽(MTT)比色試驗(yàn)檢測被攻擊后細(xì)胞的存活和生長情況；使用免疫熒光染色觀察不同時(shí)間點(diǎn)納米細(xì)菌于上皮細(xì)胞的空間位置關(guān)系；透射電鏡下觀察被納米細(xì)菌攻擊后的膽囊上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變。 結(jié)

7、果：使用鈍性刮擦法，置于含20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5％CO<,2>、飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)，成功地進(jìn)行了人膽囊上皮細(xì)胞的分離和體外原代培養(yǎng)，并理想貼壁，制作了細(xì)胞爬片。納米細(xì)菌菌株Se90與人膽囊上皮細(xì)胞爬片混合培養(yǎng)后，光鏡下觀察不同濃度納米細(xì)菌侵襲細(xì)胞爬片后的情況。隨著時(shí)間推移，被攻擊的膽囊上皮細(xì)胞逐漸出現(xiàn)水腫，分離，隨后細(xì)胞破碎，胞核溶解消失，此過程中未發(fā)現(xiàn)明顯凋亡小體形成。將納米細(xì)菌和膽囊上皮細(xì)胞爬片混合培養(yǎng)，

8、檢測不同時(shí)間含不同濃度納米細(xì)菌混合培養(yǎng)液的上清液中四唑鹽(MTT)的值，比較48和72小時(shí)MMT結(jié)果，稍高濃度組(OD=0.02)吸光度值均明顯低于低濃度組的吸光度值(P<0.01)； 在72小時(shí)低濃度組(OD=0.005)比對(duì)照組吸光度低，比較差異具有顯著性(P<0.01)，而在48小時(shí)該組與對(duì)照組比較，差異無顯著性。免疫熒光染色顯示，納米細(xì)菌可以在較短時(shí)間內(nèi)進(jìn)入膽囊上皮細(xì)胞中，且隨著時(shí)間的推移，進(jìn)入膽囊上皮細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌逐漸增

9、多，直至進(jìn)入?yún)R集于胞核。在電鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，膽囊上皮細(xì)胞受到納米細(xì)菌攻擊以后，細(xì)胞表面豐富的微絨毛減少，細(xì)胞內(nèi)線粒體腫脹明顯，嚴(yán)重情況下細(xì)菌侵入細(xì)胞內(nèi)部，造成細(xì)胞破裂壞死。 結(jié)論：適宜的方法和條件能有效進(jìn)行膽囊上皮細(xì)胞的體外原代培養(yǎng)；納米細(xì)菌可以在短時(shí)間內(nèi)迅速進(jìn)入膽囊上皮細(xì)胞并對(duì)其產(chǎn)生損傷作用，產(chǎn)生從大體形態(tài)到超微結(jié)構(gòu)的一系列改變；且細(xì)菌濃度越高，作用時(shí)間越長，造成的損傷越嚴(yán)重；較短時(shí)間內(nèi)(48 小時(shí)內(nèi))被攻擊的膽囊上

10、皮細(xì)胞大部分的死亡方式是壞死而不是凋亡。 第三章納米細(xì)菌損傷人膽囊上皮細(xì)胞的機(jī)制初步探討 目的：從自由基以及細(xì)胞炎性因子的角度初步探討納米細(xì)菌對(duì)人膽囊上皮細(xì)胞的損傷機(jī)制。 方法：0.5 Mcfarland 濃度納米細(xì)菌攻擊人膽囊上皮細(xì)胞以后，分別于不同時(shí)間點(diǎn)吸取培養(yǎng)上清液，按照試劑盒說明，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)或RT-PCR方法，進(jìn)行 LDH，MDA，IL-1β，IL-6的含量檢測。 結(jié)果：檢

11、測結(jié)果顯示納米細(xì)菌攻擊膽囊上皮細(xì)胞以后，隨著攻擊的時(shí)間延長，LDH 活性逐漸升高，72小時(shí)內(nèi)各組比較差異具有顯著性(P<0.01)；同時(shí)各時(shí)間點(diǎn)MDA含量差異除了24小時(shí)組與對(duì)照組比較差異稍有顯著性，其余各組之間差異無顯著性(P>0.05)；隨著時(shí)間延長，IL-6 的表達(dá)逐漸增高，至24小時(shí)達(dá)到高峰，72小時(shí)內(nèi)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組各時(shí)點(diǎn)間比較差異具有顯著性(P<0.01)；隨攻擊時(shí)間延長，IL-1βmRNA 的表達(dá)量逐漸升高，1個(gè)小時(shí)(0.3

12、5±0.03)，6個(gè)小時(shí)(0.68±0.06)，12個(gè)小時(shí)(0.91±0.04)，24小時(shí)(1.14±0.07)實(shí)驗(yàn)組內(nèi)各個(gè)時(shí)點(diǎn)之間比較有明顯差異(P<0.01)，而對(duì)照組的膽囊上皮細(xì)胞IL-1βmRNA未見明顯表達(dá)，兩組各時(shí)點(diǎn)間比較差異具有顯著性(P<0.01)。 結(jié)論：納米細(xì)菌株Se90攻擊人膽囊上皮細(xì)胞，能產(chǎn)生大量的IL-1β，IL-6 等細(xì)胞因子，直接或者間接地導(dǎo)致細(xì)胞損傷。在損傷過程中可能沒有自由基的參與而與大量的細(xì)胞