抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用縮小細(xì)菌耐藥突變選擇窗的研究.pdf

1、細(xì)菌耐藥是一個極為復(fù)雜的問題，應(yīng)該從多個方面給與重視，其中臨床上給藥劑量的不規(guī)范是導(dǎo)致細(xì)菌耐藥的一個重要因素。1999年突變選擇窗理論的提出恰恰解決了這一問題，該理論認(rèn)為：耐藥突變體亞群在應(yīng)用抗菌藥物治療之前已經(jīng)存在，而在應(yīng)用抗菌藥物治療時，如果抗菌藥物的濃度位于突變選擇窗(mutant selection window, MSW)之間，耐藥突變體會選擇性富增，MSW的上界值為防耐藥突變濃度(mutant prevention conc

2、entration，MPC)。因此，關(guān)閉或者縮小MSW可以較少細(xì)菌發(fā)生耐藥突變的機(jī)會。當(dāng)兩種不同作用機(jī)制的抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用，并同時處于各自的MIC之上時，細(xì)菌需要同時發(fā)生兩種耐藥突變才能生長從而關(guān)閉MSW，從而有效控制細(xì)菌耐藥。目的
　　 在體外和動物體內(nèi)探討抗菌藥物的聯(lián)合應(yīng)用能否縮小細(xì)菌對單藥的耐藥突變選擇窗，能否有效控制細(xì)菌耐藥。同時觀察突變選擇窗內(nèi)細(xì)菌的耐藥機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.體外試驗(yàn)：選擇銅綠

3、假單胞菌、金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌三種細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行試驗(yàn)。
　　 1.1銅綠假單胞菌：選擇頭孢他啶(CAZ)、阿米卡星(AMK)和環(huán)丙沙星(CIP)為試驗(yàn)藥物，分別應(yīng)用瓊脂平板稀釋法和棋盤格法測定單藥以及兩兩聯(lián)合聯(lián)合之后的MIC。瓊脂平板稀釋法測定單藥及兩兩聯(lián)合時對銅綠假單胞菌的防耐藥突變濃度MPC，并計算選擇指數(shù)SI(MPC/MIC)，觀察能否縮小突變選擇窗。
　　 1。2金黃色葡萄球菌：分別應(yīng)用E-test與瓊

4、脂平板稀釋法測定萬古霉素對金黃色葡萄球菌的MIC與MPC，同時應(yīng)用棋盤格法和瓊脂平板稀釋法測定聯(lián)合左氧氟沙星與利福霉素后萬古霉素的MIC與MPC，并計算選擇指數(shù)SI，觀察能否縮小突變選擇窗。
　　 1.3大腸埃希菌：選擇環(huán)丙沙星(CIP)與阿米卡星(AMK)為試驗(yàn)藥物，分別應(yīng)用瓊脂平板稀釋法和棋盤格法測定單獨(dú)以及聯(lián)合之后的MIC，瓊脂平板稀釋法測定單獨(dú)及聯(lián)合時對大腸埃希菌的防耐藥突變濃度MPC，并計算相應(yīng)的選擇指數(shù)SI，觀察能否

5、縮小突變選擇窗。
　　 2.耐藥機(jī)制的初步分析：選擇銅綠假單胞菌為代表，觀察主動外排系統(tǒng)在突變選擇窗內(nèi)細(xì)菌耐藥所起的作用。2.1 E-test測定美羅培南(MEM)、頭孢他啶(CAZ)、阿米卡星(AMK)、環(huán)丙沙星(CIP)四種抗銅綠假單胞菌藥物單藥MIC。2.2棋盤格法測定聯(lián)合利血平、奧美拉唑、阿奇霉素、CCCP、PaβN五種外排抑制劑后抗菌藥物對銅綠假單胞菌的最低抑菌濃度MIC。2.3瓊脂平板二倍稀釋法測定抗菌藥物單藥以及聯(lián)

6、合外排抑制劑后防耐藥突變濃度(MPC)，并計算相應(yīng)的選擇指數(shù)SI。同時用美羅培南、頭孢他啶、環(huán)丙沙星分別聯(lián)合阿米卡星，阿米卡星聯(lián)合環(huán)丙沙星，分別測定聯(lián)合前后的SI，比較聯(lián)合抗菌藥物與聯(lián)合外排抑制劑在防銅綠假單胞菌耐藥突變的能力，分析主動外排系統(tǒng)在突變選擇窗內(nèi)細(xì)菌耐藥所起的作用。
　　 3.動物實(shí)驗(yàn)：在家兔體內(nèi)觀察環(huán)丙沙星聯(lián)合妥布霉素后，能否降低環(huán)丙沙星對銅綠假單胞菌的防耐藥突變濃度，控制細(xì)菌耐藥。
　　 3.1、建立兔組

7、織籠感染模型；
　　 3.2、高效液相色譜法測定環(huán)丙沙星在兔組織液中藥代動力學(xué)參數(shù)；
　　 3.3、試驗(yàn)分組：55只家兔隨機(jī)分為11組，1組為生理鹽水組最為對照，5個組為單用環(huán)丙沙星，其余5個組為環(huán)丙沙星聯(lián)合妥布霉素，每組5只家兔。每只均注入1010cfu/m1濃度的銅綠假單胞菌ATCC278531m1，
　　 3.4、給藥方案：環(huán)丙沙星按照藥代動力學(xué)參數(shù)設(shè)計給藥方案，一天內(nèi)10次給藥，每次給藥間隔2小時，使單藥

8、組與聯(lián)合組家兔血環(huán)丙沙星穩(wěn)態(tài)濃度分別均達(dá)到1MIC、2MIC、4MIC、8MIC、16MIC濃度，聯(lián)合組妥布霉素給藥方案參照參考文獻(xiàn)，是其穩(wěn)態(tài)濃度均達(dá)到其2-4MIC濃度，治療三天，抽取組織液，稀釋后涂布瓊脂平板，觀察耐藥突變體生長情況。
　　 結(jié)果：
　　 1、體外實(shí)驗(yàn)：
　　 1，1、銅綠假單胞菌：CIP、AMK、CAZ單藥對銅綠假單胞菌的SI分別為16、16、＞32。兩兩聯(lián)合后各自單藥的SI分別為：CIP+

9、AMK(CIP-8：AMK-4)：CIP+CAZ(CIP-4;CAZ-8);AMK+CAZ(AMK-8:CAZ-4)。1.2、金黃色葡萄球菌：萬古霉素對金黃色葡萄球菌ATCC29213的MIC、MPC以及SI分別為1.0μg/mL、51.2μg/mL、51.2，萬古霉素分別聯(lián)合利福霉素與左氧氟沙星后的MPC及SI分別為12.8μg/mL、25.6；8.0μg/mL、16.0。1.3、大腸埃希菌：CIP、AMK單藥對大腸埃希菌的SI分別為

10、16和32。兩者聯(lián)合應(yīng)用時，當(dāng)AMK濃度達(dá)到2MIC、CIP達(dá)到其2MIC時便可抑制耐藥突變體產(chǎn)生。聯(lián)合后的SI分別為8(0.008/0.001)和8(2/0.25)。2、耐藥機(jī)制的初步分析：MEM、CAZ、AMK、CIP四種抗菌藥物單藥的SI分別為＞32，＞32，16，16; MEM、CAZ、AMK、CIP與利血平聯(lián)合后SI分別為16、16、16、8；與奧美拉唑聯(lián)合后分別為16、32、16、8；與阿奇霉素聯(lián)合后分別為8、16、16、8

11、；與CCCP聯(lián)合后分別為8、8、16、8；與PaβN聯(lián)合后分別為8、16、16、8。MEM、CAZ、CIP分別與AMK聯(lián)合后的SI分別為4、4、8。阿米卡星與環(huán)丙沙星聯(lián)合后阿米卡星的SI為4。
　　 3動物實(shí)驗(yàn)：
　　 3.1、單用環(huán)丙沙星組：1MIC、2MIC、4MIC、8MIC組家兔組織液中均有耐藥突變體的生長，隨濃度提高，菌落數(shù)逐漸減少，16MIC組沒有耐藥突變體生長。
　　 3.2、環(huán)丙沙星聯(lián)合妥布霉素組

12、：環(huán)丙沙星濃度為1MIC、2MIC組有耐藥突變體生長，4MIC、8MIC、16MIC組沒有耐藥突變體的生長。
　　 結(jié)論：
　　 體外體內(nèi)試驗(yàn)證實(shí)，兩種抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用可以縮小細(xì)菌藥耐藥突變選擇窗，減少耐藥突變體產(chǎn)生的機(jī)會，從而有效控制細(xì)菌耐藥?？咕幬锱c外排抑制劑聯(lián)合可以縮小突變選擇窗，但作用弱于兩種抗菌藥物聯(lián)合，從而推測突變選擇窗內(nèi)富集擴(kuò)增的耐藥菌，在高于MIC濃度的抗菌藥物壓力下，主動外排系統(tǒng)只有少量激活，也沒有新