合肥地區(qū)新生兒人巨細(xì)胞病毒先天性感染的基因型分析.pdf

1、目的：本研究采集正常產(chǎn)婦抗凝臍帶血樣本進(jìn)行人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalo virus,HCMV)分離和鑒定,分析探討合肥地區(qū)HCMV先天性感染的分子流行病學(xué)特征和病毒糖蛋白B基因型別。為進(jìn)一步研究其致病性、免疫性以及研制HCMV亞單位疫苗提供依據(jù)。
　　方法：從臨床采集正常順產(chǎn)婦(年齡在19~38歲)的臍帶血樣本160例,按實(shí)驗(yàn)設(shè)計分別作如下處理:(1)HCMV先天性感染的實(shí)驗(yàn)室檢測:HCMV病毒分離,將樣本接種至

2、人胚成纖維細(xì)胞(HF)上,觀察CPE(Cyto pathic effect,CPE),對分離得到的病毒株應(yīng)用間接免疫熒光法(indirectimmuno fluorescence assay,IFA)鑒定后,體外培養(yǎng)病毒并提取DNA采用PCR檢測HCMVIE和UL83基因。同時應(yīng)用pp65抗原血癥的方法直接檢測臍帶血白細(xì)胞樣本中HCMVpp65抗原。記錄分析結(jié)果,確定合肥地區(qū)新生兒HCMV先天性感染率。(2)HCMV先天性感染臨床分離株

3、的基因型分析:通過限制性片段長度多態(tài)性分析(RFLP)對RsaI和HinfI酶切位點(diǎn)的突變情況進(jìn)行分析;對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化后測序,并且使用MEGA4.0軟件用鄰接法(neighbor joining)構(gòu)建進(jìn)化樹。(3)建立隨訪檔案,HCMV先天性感染臨床資料的收集與分析:對HCMV先天性感染的新生兒建立隨訪檔案,對其進(jìn)行回顧性調(diào)查以及遠(yuǎn)期臨床追蹤調(diào)查,特別是基因變異較大的新生兒應(yīng)該作為首選隨訪對象。
　　結(jié)果：(1)HCMV先天

4、性感染的實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果:從臨床采集的160份樣本中經(jīng)病毒分離鑒定后得到陽性樣本40份,病毒分離陽性率為25.0％,pp65抗原血癥的方法得到陽性樣本39份,陽性率為24.4%。分析結(jié)果后確定合肥地區(qū)HCMV先天性感染率約為25.0%。(2)HCMV先天性感染臨床分離株的基因型分析:應(yīng)用RFLP分析,結(jié)果顯示:40例陽性標(biāo)本均為gB-2型,未見其他型別。同時發(fā)現(xiàn)該基因型已有變異,其中HeFei-01,HeFei-03和HeFei-21標(biāo)本

5、分別有24(7.95%)個,28個(9.27%)和30個突變位點(diǎn)(9.93%)。MEGA4.0軟件繪制的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示:所有的臨床樣本與HCMVAD169株在同一個側(cè)枝上,但是HeFei-01,HeFei-03和HeFei-21三株臨床樣本變異很大,與HCMVgB-2型的進(jìn)化距離較遠(yuǎn)。(3)建立隨訪檔案,HCMV先天性感染臨床資料的收集與分析:HeFei-21分離株的新生兒出生時出現(xiàn)早產(chǎn),胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩,出生時低體質(zhì)量,出生時體重僅2

6、.2千克,符合宮內(nèi)發(fā)育遲緩的診斷標(biāo)準(zhǔn)。
　　結(jié)論：(1)對160例正常順產(chǎn)婦所娩新生兒的抗凝臍帶血進(jìn)行HCMV較系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室檢測和鑒定,初步確定合肥地區(qū)正常順產(chǎn)婦所娩新生兒HCMV先天性感染率的基線數(shù)據(jù)約為25.0%;(2)對于鑒定為HCMV先天性感染的樣本分別命名為HeFei-01~HeFei-40。HCMV先天性感染的gB基因序列比對及進(jìn)化樹分析表明:合肥地區(qū)正常順產(chǎn)婦所娩新生兒HCMV先天性感染的基因型別均為gB-2型,未見