Cbl-b shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MGC803細(xì)胞系的構(gòu)建.pdf

1、目的：
　　 構(gòu)建靶向Cbl-b基因的短發(fā)夾環(huán)RNA（shRNA）真核質(zhì)粒表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染至MGC803胃癌細(xì)胞中，用G418進(jìn)行篩選，建立Cbl-b shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MGC803細(xì)胞株，并進(jìn)行檢測(cè)。利用這種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的胃癌MGC803細(xì)胞系，進(jìn)行Cbl-b調(diào)節(jié)EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的相關(guān)研究。
　　 方法：
　　 1、引物設(shè)計(jì)
　　 根據(jù)Cbl-b基因序列，通過(guò)軟件設(shè)計(jì)三個(gè)靶序列，利用BLAST進(jìn)行同源

2、性分析，設(shè)計(jì)出2組Cbl-b shRNA序列及1組對(duì)照靶序列。shRNA排列順序均為：BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)+反義序列+loop+正義序列+TC+HindⅢ和BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)+正義序列+loop+反義序列+AG+HindⅢ。
　　 2、構(gòu)建Cbl-b ShRNA質(zhì)粒
　　 選用pRNA-U6.1/Neo（Genscript，Piscatcway）作為載體?；瘜W(xué)合成法合成shRNA序列，將配對(duì)的單鏈合成雙鏈，采用Bam-

3、HI/HindⅢ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切后，以T4連接酶連接于同樣經(jīng)過(guò)采用Bam-HI/HindⅢ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切后的pRNA-U6.1/Neo載體內(nèi)。將構(gòu)建成的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)菌DH5α中，將菌液涂布于含有氨芐青霉素的LB平板，篩選陽(yáng)性菌落。
　　 3、測(cè)序
　　 對(duì)構(gòu)建完畢的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，通過(guò)檢測(cè)結(jié)果可以看出三段引物均成功插入質(zhì)粒內(nèi)。測(cè)序確認(rèn)后進(jìn)行大量復(fù)制、擴(kuò)增，提取重組質(zhì)粒。
　　 4、基因轉(zhuǎn)染

4、　　 用含10％新生小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)MGC803胃癌細(xì)胞。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞于轉(zhuǎn)染前24小時(shí)，按每孔1×104個(gè)細(xì)胞密度接種于6孔培養(yǎng)板，當(dāng)細(xì)胞達(dá)85-95％時(shí)按照，Lipofectamine 2000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，換為G418培養(yǎng)液，培養(yǎng)2周后，顯微鏡觀察后，挑選克隆。
　　 5、Western Blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中Cbl-b的表達(dá)
　　 收集轉(zhuǎn)染后細(xì)胞進(jìn)行裂解，提取細(xì)胞蛋白

5、，取20μg處理后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳并電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5％脫脂奶封閉1h，一抗孵育1h，TBST洗膜，然后二抗孵育30min，TBST洗膜后加入ECL發(fā)光液，孵育5min，暗室中用X片曝光，顯影，定影。以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞系和轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒的細(xì)胞系作為對(duì)照，選取表達(dá)率為對(duì)照組10％以下的細(xì)胞株為陽(yáng)性細(xì)胞株。
　　 6、MTT法檢測(cè)四種胃癌細(xì)胞的增殖
　　 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的未轉(zhuǎn)染胃癌MGC803細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后的空白對(duì)

6、照，Cbl-b基因沉默胃癌MGC803細(xì)胞，進(jìn)行胰蛋白酶消化，消化后用培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至3×104個(gè)/ml，按每孔200μl接種于96孔板，37℃分別培養(yǎng)24h，48h，72h后，加入MTT，于相同培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)4h。加入DMSO，在恒溫振蕩器上振蕩10min，室溫20min孵育。放入酶標(biāo)儀中以490nm波長(zhǎng)檢測(cè)光密度值（optical density，OD）。空白調(diào)零組A490的OD值均數(shù)設(shè)為零，以平行孔的平均O

7、D值作為各組的OD值。
　　 7、Western Blot檢測(cè)沉默Cbl-b后對(duì)P-ERK及p-AKT的影響
　　 收集轉(zhuǎn)染后三種細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染胃癌MGC803細(xì)胞進(jìn)行Western Blot檢測(cè)，分別加入抗AKT及抗ERK抗體孵育1h，TBST洗膜，二抗孵育，洗膜，加入ECL發(fā)光液，孵育5min，曝光，顯影，定影。以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞系和轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒的細(xì)胞系作為對(duì)照，比較AKT及ERK表達(dá)的變化。
　　 結(jié)果：
　

8、　 1、設(shè)計(jì)pRNA-U6.1/Neo-cbl靶序列和空白對(duì)照序列
　　 根據(jù)Cbl-b基因序列，設(shè)計(jì)Cbl-b靶序列2組（shRNA414，shRNA852）進(jìn)行同源性分析，設(shè)計(jì)出2組Cbl-b shRNA序列及1組對(duì)照靶序列。
　　 2、測(cè)序
　　 結(jié)果表明shRNA414，852，和空白對(duì)照模板成功構(gòu)建于pRNA-U6.1/Neo載體上，序列完全正確，與目的序列相同。
　　 3、空白對(duì)照組和Cbl

9、-b基因沉默胃癌MGC803細(xì)胞系篩選
　　 利用Western Blot檢測(cè)，選取與未轉(zhuǎn)染的MGC-803細(xì)胞Cbl-b表達(dá)水平相同的，轉(zhuǎn)染空白對(duì)照組細(xì)胞為對(duì)照組細(xì)胞，選取Cbl-b表達(dá)水平為未轉(zhuǎn)染組的10％以下的細(xì)胞系為Cbl-b基因沉默細(xì)胞系。
　　 4、對(duì)照組和Cbl-b基因沉默胃癌MGC803細(xì)胞增殖
　　 通過(guò)進(jìn)行MTT檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞增殖24h后，Cbl-b基因沉默胃癌MGC803細(xì)胞（shRNA4

10、14，shRNA852）增殖逐漸增快，與空白對(duì)照及未轉(zhuǎn)染細(xì)胞比較差異顯著。
　　 5、沉默Cbl-b后對(duì)p-ERK及p-AKT的影響
　　 通過(guò)Western Blot檢測(cè)，在Cbl-b基因沉默細(xì)胞中，p-AKT表達(dá)較未轉(zhuǎn)染細(xì)胞和空白對(duì)照細(xì)胞明顯上調(diào)。而在p-ERK表達(dá)方面，四種細(xì)胞無(wú)明顯差別。
　　 結(jié)論：
　　 1、成功構(gòu)建泛素連接酶Cbl-b ShRNA質(zhì)粒。
　　 2、成功建立Cbl-b被