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文檔簡介
1、模式識別受體在抗感染免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。NLRP3(NACHT,LRR and PYD domains-containing protein3)受體和MDA5(Melanoma differentiation associated gene5)分別為NOD樣受體家族(Nucleotide-binding oligomerization domain like receptors)和RIG樣受體家族(Retinoicacidinduc
2、ible gene I like receptors)中的重要成員,可被病毒RNA激活,介導(dǎo)NF-κB信號通路引起下游免疫因子的成熟、釋放,參與胞內(nèi)免疫應(yīng)答反應(yīng)。相比哺乳動物,有關(guān)禽類NLRP3和MDA5分子特征和調(diào)控機制尚不清楚。本文分別對NLRP3(chNLRP3)和雞MDA5(chMDA5)受體基因進(jìn)行克隆、表達(dá)并制備出相應(yīng)抗體,為進(jìn)一步探究其參與天然抗病毒免疫應(yīng)答的作用機制奠定基礎(chǔ)。
首先,通過設(shè)計特異性引物分別以RT
3、-PCR擴(kuò)增chNLRP3和SOE-PCR擴(kuò)增chMDA5受體基因CDS序列,與pEASY-Blunt克隆載體連接、轉(zhuǎn)化E.coli DH5α菌,經(jīng)菌液PCR和雙酶切鑒定,將陽性克隆進(jìn)行基因測序并分析其同源性。結(jié)果顯示,我們克隆出chNLRP3和chMDA5受體基因,大小分別為2205bp和3306bp;成功構(gòu)建了pEASY-Blunt-chNLRP3和pEASY-Blunt-chMDA5克隆重組質(zhì)粒;對chNLRP3及chMDA5氨基
4、酸推導(dǎo)序列與已知物種的相應(yīng)序列比對后發(fā)現(xiàn),本實驗室獲得 chNLRP3推導(dǎo)氨基酸序列與黃羽肉雞NLRP3(KF318520)同源性最高,為95.2%。與魚(XM_01504447)同源性最低,僅為4.8%,且不在同一分支,相對親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。chMDA5氨基酸推導(dǎo)序列較原雞(AB_371640)同源性較高,為97.2%,與草魚(JN_986720)的同源性為42.1%,同樣不在同一分支,相對親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。
其次,通過DNASta
5、r軟件對chNLRP3和chMDA5受體的抗原表位進(jìn)行預(yù)測,選取抗原表位較為集中的N端氨基酸片段(chNLRP3第1-200位氨基酸,chMDA5第1-255位氨基酸),設(shè)計相應(yīng)PCR擴(kuò)展引物,以pEASY-Blunt-chNLRP3和pEASY-Blunt-chMDA5重組質(zhì)粒為模板,擴(kuò)增目的片段,分別插入pET-32a原核表達(dá)載體,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)并純化,分別免疫家兔制備抗血清并經(jīng)ELISA和western blot方法鑒
6、定。結(jié)果表明,通過PCR擴(kuò)增出chNLRP3和chMDA5截短基因片段,大小分別為600bp和765bp,構(gòu)建出pET-32a/chNLRP3和pET-32a/MDA5原核表達(dá)重組質(zhì)粒,獲得純化的融合蛋白免疫新西蘭兔,制備出兔抗His/chNLRP3(1-200aa)和His/MDA5(1-255aa)融合蛋白多克隆抗體,經(jīng)ELISA和western blot檢測結(jié)果表明,所獲的2種抗體均可與相應(yīng)免疫原發(fā)生特異性結(jié)合。
最后,
7、分別亞克隆chNLRP3和chMDA5受體基因至pmCherry-N1和pEGFP-N1真核表達(dá)質(zhì)粒,將兩種質(zhì)粒分別通過脂質(zhì)體(Lipofectamine)3000瞬時轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞,培養(yǎng)48h后在倒置熒光顯微鏡下觀察融合蛋白表達(dá)情況。裂解細(xì)胞,通過SDS-PAGE電泳后,通過相應(yīng)抗體進(jìn)行Western blot檢測chNLRP3和chMDA5融合蛋白表達(dá)情況。結(jié)果表明,我們構(gòu)建出真核表達(dá)重組質(zhì)粒chNLRP3/Cherry-N1和c
8、hMDA5/GFP-N1,將其轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞后,通過顯微熒光觀察和western blot方法能檢測到過表達(dá)NLRP3和MDA5融合蛋白。以所制備的抗體能夠檢測到相應(yīng)與理論蛋白分子量一致的融合蛋白,大小分別為108.6kDa和137.2kDa。
綜上所述,本研究克隆了雞NLRP3和MDA5基因,并構(gòu)建出相應(yīng)原核表達(dá)重組質(zhì)粒,經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá),蛋白純化及免疫新西蘭兔,制備出相應(yīng)兔抗chNLRP3和chMDA5多克隆抗體;構(gòu)建chNL
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