探討TIPE在胃癌中的表達(dá)及其臨床意義.pdf

1、背景及意義:胃癌是嚴(yán)重危害人類健康的最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率位居所有惡性腫瘤的第二位，死亡率列所有惡性腫瘤的第三位，目前臨床上大多數(shù)患者確診胃癌時(shí)已是中晚期，根治性手術(shù)仍然是胃癌的主要治療方式，也是唯一有希望治愈胃癌的手段，但手術(shù)效果不佳，直接影響愈后。因此深入研究胃癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，可為胃癌早期診斷提供依據(jù)，同時(shí)也為臨床治療提供有效的靶點(diǎn)治療，具有重要的臨床意義。腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白8(Tumor necrosisfact

2、or-α induced protein-8，TIPE，TNFAIP8)是調(diào)控凋亡過程的重要分子之一。TIPE蛋白在細(xì)胞凋亡、信號(hào)傳導(dǎo)、腫瘤細(xì)胞增生、侵襲及轉(zhuǎn)移等生命過程中具有重要的調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)研究通過在細(xì)胞水平和分子水平上檢測(cè)TIPE蛋白及mRNA在胃癌組織中的表達(dá)，并分析它們與胃癌臨床病理特征的關(guān)系，探討TIPE與胃癌生物學(xué)行為的關(guān)系，分析TIPE對(duì)胃癌生長(zhǎng)的影響。
　　方法:第一部分:(1)利用半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)

3、(RT-PCR)法檢測(cè)46例胃癌組織及癌旁正常組織中TIPE mRNA的表達(dá)，并對(duì)條帶灰度檢測(cè)分析不同組織TIPE mRNA的表達(dá)情況。(2)免疫組化S-P法檢測(cè)胃癌組織及癌旁正常組織中TIPE蛋白的表達(dá)，根據(jù)RT-PCR灰度分析及免疫組化結(jié)果，結(jié)合臨床病理資料，分析TIPE在胃癌發(fā)生、發(fā)展以及浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的關(guān)系。
　　第二部分:(1)我們實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建TIPE-shRNA-pSIREN-RetroQ干擾質(zhì)粒和pSIREN-Retro

4、Q陰性對(duì)照質(zhì)粒，利用shRNA技術(shù)轉(zhuǎn)染BGC823細(xì)胞干擾TIPE蛋白的表達(dá)。BGC823細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TIPE-shRNA-pSIREN-RetroQ干擾質(zhì)粒（干擾組），BGC823細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pSIREN-RetroQ（陰性對(duì)照組），正常BGC823胃癌細(xì)胞（空白組）。應(yīng)用蛋白免疫印跡方法(Western blot)和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法鑒定轉(zhuǎn)染效果，(2)應(yīng)用抗DR5單鏈抗體aDR5ScFv刺激后通過細(xì)胞流式術(shù)、臺(tái)

5、盼藍(lán)染色、MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TIPE不同表達(dá)的BGC823細(xì)胞的生長(zhǎng)及凋亡情況，Western blot檢測(cè)凋亡蛋白caspase-8、caspase-3、caspase-9的活化，進(jìn)而探討TIPE在胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)中的作用。
　　第三部分:(1)應(yīng)用TIPE不同表達(dá)的BGC823細(xì)胞株，接種于裸鼠右腋旁建立裸鼠胃癌移植瘤模型，(2)每天應(yīng)用aDR5ScFv單鏈抗體治療并測(cè)量裸鼠體重及腫瘤大小，治療兩周后摘取腫瘤稱重，腫瘤組織經(jīng)HE染色和

6、TUNEL染色分析TIPE對(duì)胃癌生長(zhǎng)的影響，對(duì)凋亡誘導(dǎo)劑的敏感性。
　　結(jié)果:胃癌組織和癌旁正常組織中TIPE蛋白均有表達(dá)，TIPE mRNA在胃癌中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織(P＜0.05)，兩者差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，TIPE mRNA與胃癌分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM相關(guān)(P＜0.05)，與性別、年齡無關(guān)(P＞0.05)。
　　利用TIPE不同表達(dá)的胃癌BGC823細(xì)胞株，經(jīng)MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)aDR5ScFv的濃度分

7、別為40ug/ml、80ug/ml、160ug/ml、320ug/ml作用細(xì)胞8h后，干擾組細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率分別為:33.73±1.79％、53.51±3.36％、67.30±1.47％，95.16±0.34％。而空白組細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率分別為:21.92±1.66％、47.45±2.99％、56.67±4.59％、82.20±0.56％，陰性對(duì)照組細(xì)胞分別為:18.63±3.01％、41.64±1.78％、56.74±0.76％、85.

8、26±1.15％，干擾組顯示較強(qiáng)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用，與其他兩組相比，差異顯著(P＜0.05)。應(yīng)用臺(tái)盤蘭染色檢測(cè)0.1mg/ml aDR5ScFv作用三組細(xì)胞12h、24h、36h的細(xì)胞死亡率。其中，干擾組為32.20±3.20％、45.33±2.35％、68.73±4.74％，空白組為21.30±1.41％、36.73±3.71％、60.33±1.83％，陰性對(duì)照組為19.73±1.42％、40.67±0.98％、53.17±1.79

9、％，干擾組顯示較多的細(xì)胞死亡率，與其他兩組相比，差異顯著具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示各組細(xì)胞的凋亡率不同，其中，空白組19.40％，陰性對(duì)照組17.98％;干擾組31.68％。以上結(jié)果提示TIPE被干擾后提高了BGC823細(xì)胞對(duì)aDR5ScFv誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的敏感性。通過蛋白免疫印跡方法(Western blot)發(fā)現(xiàn)干擾組caspase-8、caspase-9和caspase-3的活化增強(qiáng)，提示TIPE低表達(dá)可

10、以通過增強(qiáng)caspase活化提高BGC823細(xì)胞的凋亡敏感性。
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察到，干擾組與空白組相比，aDR5ScFv作用不同TIPE表達(dá)的細(xì)胞建立的腫瘤模型，腫瘤生長(zhǎng)呈不同的特點(diǎn)，干擾組14天腫瘤質(zhì)量與體積分別為（0.008±0.002g，94.987±24.287mm3），陰性對(duì)照組裸鼠腫瘤質(zhì)量與體積分別為（0.016±0.003g，178.387±8.083mm3），組間差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　生理鹽水作用干

11、擾組14天腫瘤質(zhì)量與體積分別為（0.019±0.004g，232.586±31.632mm3），陰性對(duì)照組14天腫瘤質(zhì)量與體積分別為（0.026±0.003g，252.825±34.883mm3）組間差異顯著(P＜0.05)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而各組裸鼠體重變化無明顯差異(P＞0.05)，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示轉(zhuǎn)染細(xì)胞安全可用。
　　aDR5ScFv作用干擾組，HE染色結(jié)果顯示腫瘤組織壞死明顯，腫瘤細(xì)胞之間可見較多片狀壞死及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)