基因多態(tài)性對(duì)卡馬西平及其衍生物奧卡西平藥動(dòng)學(xué)及藥效學(xué)的影響.pdf

1、本文分析了基因多態(tài)性對(duì)卡馬西平及其衍生物奧卡西平藥動(dòng)學(xué)及藥效學(xué)的影響。本研究分為四個(gè)部分：
　　第一章：HPLC法測(cè)定抗癲癇藥物濃度的方法建立。
　　目的：建立同時(shí)測(cè)定人血漿中唑尼沙胺（zonisamide，ZNS）、撲米酮(primidone，PRI)、拉莫三嗪(lamotrigine，LTG)、苯巴比妥(phenobarbital，PB)、苯妥英(phenytoin，PHT)、奧卡西平(oxcarbazepine，OXC

2、)、卡馬西平(carbamazepine，CBZ)及兩種活性代謝物單羥奧卡西平（monohydroxycar-bazepine，MHD）、環(huán)氧卡馬西平（carbamazepine10，11-epoxide，CBZE）濃度的HPLC方法。
　　方法：以鹽酸普萘洛爾為內(nèi)標(biāo)，血漿樣品經(jīng)甲醇蛋白沉淀法處理后直接進(jìn)樣測(cè)定。色譜柱采用Agilent Zorbax RX-C8柱(4.6 mm×250 mm，5μm)，流動(dòng)相為甲醇∶乙腈∶0.1％

3、三氟乙酸水溶液(235∶120∶645，v/v/v)，流速為1.5 mL· min-1，雙波長(zhǎng)雙通道檢測(cè)，在215 nm測(cè)定PRI、LTG、MHD、PB、PHT和CBZE，235 nm處測(cè)定ZNS、OXC和CBZ。
　　結(jié)果：血漿內(nèi)源性雜質(zhì)和常用合并用藥對(duì)樣品測(cè)定無(wú)干擾，色譜峰分離良好，ZNS、PRI、LTG、MHD、PB、CBZE、OXC、PHT和CBZ的最低定量下限分別為1.0，5.0，1.0，1.0，5.0，1.0，0.5，

4、1.0，1.0μg·mL-1，線性范圍分別是1～80，5～50，1～25，1～50，5～100，1～10，0.5～25，1～50，1～25μg·mL-1，相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.996。平均方法回收率分別為101.26％，101.33％，101.31％，105.08％，100.08％，100.04％，101.64％，103.27％和102.09％。各組分的日內(nèi)、日間RSD均小于11.58％。樣品在25℃放置4小時(shí)，4℃放置24小時(shí)，反復(fù)

5、凍融3次均保持穩(wěn)定。
　　結(jié)論：該方法具有良好的準(zhǔn)確性、精密性和靈敏性，且操作快速、簡(jiǎn)便、穩(wěn)定，各組分之間分離良好，適用于臨床抗癲癇藥物血藥濃度的監(jiān)測(cè)。
　　第二章：基因多態(tài)性對(duì)卡馬西平藥動(dòng)學(xué)的影響。
　　目的：卡馬西平(Carbamazepine，CBZ)是目前臨床上最常用的抗癲癇藥物之一，因其治療窗窄、藥物劑量和濃度的個(gè)體差異大，臨床上需要對(duì)其進(jìn)行治療藥物監(jiān)測(cè)，并根據(jù)監(jiān)測(cè)結(jié)果和療效來(lái)調(diào)整藥物的劑量。CBZ的主要作用

6、靶點(diǎn)是鈉離子通道，編碼鈉離子通道的基因具有多態(tài)性。CBZ是P450酶系CYP3A(Cytochrome P4503A，CYP3A)、微粒體環(huán)氧化物水解酶(microsomal epoxide hydrolase，mEH)、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UDP-glucuronosyhransferase，UGT)和多藥抗藥性相關(guān)蛋白2(multidrugresistance-associated protein2，MRP2，又稱(chēng)ABCC2

7、)的底物。CYP3A、編碼mEH、UGT和ABCC2的基因具有多態(tài)性，我們推測(cè)其多態(tài)性可能影響CBZ的體內(nèi)過(guò)程，從而導(dǎo)致藥動(dòng)學(xué)上的差異。本研究的目的即是考察SCN1A/2A、CYP3A4/5、EPHX1、UGT2B7和ABCC2基因多態(tài)性對(duì)中國(guó)漢族癲癇患者卡馬西平藥動(dòng)學(xué)的影響。
　　方法：收集166例CBZ單藥治療的中國(guó)漢族癲癇患者，使用CBZ維持劑量8周以上，血藥濃度達(dá)穩(wěn)態(tài)。在早上7點(diǎn)到9點(diǎn)服藥之前采集外周靜脈血2 ml，采用高

8、分辨率熔解曲線法檢測(cè)SCN1A c.3184A＞G、SCN2A c.56G＞A和IVS7-32A＞G、CYP3A4*1G、CYP3A5*3、ABCC23972C＞T和c.1249 G＞A、UGT2B7 c.802T＞C的基因分型，Taqman探針?lè)z測(cè)SCN1A IVS5-91G＞A基因分型，測(cè)序法檢測(cè)EPHX1 c.337T＞C的基因分型。CBZ的穩(wěn)態(tài)血藥濃度采用第一部分的HPLC方法進(jìn)行測(cè)定。并以CBZ濃度/（日劑量/體重）為校正濃

9、度CDRs(Concentration-Dose ratios)，CDR取自然對(duì)數(shù)后，成正態(tài)分布，采用單因素分析法(ANOVA)和多元線性回歸法，考察基因多態(tài)性及性別、年齡、起病年齡、病程等臨床混雜因素對(duì)癲癇患者維持劑量(Maintenance Dose)和校正濃度InCDRs的影響。
　　結(jié)果：⑴166例癲癇患者中，SCN基因4個(gè)突變位點(diǎn)SCN1A IVS5-91G＞A、SCN1Ac.3184A＞G、SCN2A c.56G＞A和

10、SCN2A IVS7-32A＞G的變異頻率分別為54.8％、12.4％、13.5％和11.7％。CYP3A4*1G、CYP3A5*3、EPHX1 c.337T＞C、UGT2B7 c.802T＞C的變異頻率分別26.5％、70.5％、44.9％和64.8％。ABCC2基因2個(gè)突變位點(diǎn)3972C＞T和c.1249 G＞A的變異頻率分別為16.9％和10.5％。連鎖分析顯示SCN1A的兩個(gè)位點(diǎn)IVS5-91G＞A和c.3184A＞G，SCN2

11、A的兩個(gè)位點(diǎn)c.56G＞A和IVS7-32A＞G存在較高程度的連鎖，D'值分別為0.79和0.99。CYP3A4*1G與CYP3A5*3存在較高程度的連鎖，D'值為0.71。SCN1A/2A的4個(gè)位點(diǎn)構(gòu)建得到頻率大于3％的5種單倍體。⑵結(jié)果顯示攜帶S CN1AIVS5-91 G＞A和EPHX1 c.337T＞C突變基因的患者需要較高的CBZ維持劑量(mg/kg/day)并且表現(xiàn)為較低水平的InCDRs，三種基因型間存在顯著性差異。SCN

12、1AIVS5 AA型和GA患者比GG型患者需要更高劑量的CBZ（10.35±3.27vs8.48±1.89，10.44±3.28 vs8.48±1.89，P＜0.05）。EPHX1 c.337 CT型患者比TT型的患者需要更高劑量的CBZ（9.65±3.04vs10.98±4.08，P＜0.05）。SCN1AIVS5-91 AA和GA型患者的CBZ lnCDRs(day/ml)比野生型純合子GG型的患者顯著降低（2.38±0.14 vs

13、2.56±0.14，2.41±0.13 vs2.56±0.14，P＜0.001）。EPHX1 c.337CC型比TT型患者的CBZ lnCDRs顯著降低（2.36±0.17 vs2.46±0.12，P＜0.05）。CT和TT型患者的CBZ lnCDRs未見(jiàn)明顯差異。攜帶ABCC23972 T突變等位基因的患者比未攜帶此突變等位基因的患者需要更高劑量的CBZ維持劑量(mg/kg/day)，并存在顯著性差異（9.89±3.08 vs10.8

14、0±3.35，p=0.047），但在ABCC23972C＞T的三種基因型間未見(jiàn)到維持劑量和血藥濃度的差異。多因素分析的結(jié)果提示SCN1A IVS5-91G＞A和EPHX1 c.337T＞C與lnCDRs間存在顯著性相關(guān)。未發(fā)現(xiàn)其余8個(gè)SNPs對(duì)CBZ患者維持劑量(Maintenance Dose)和校正濃度InCDRs的影響。
　　結(jié)論：研究提示SCN1A、EPHX1基因多態(tài)性是影響CBZ的維持劑量和lnCDRs的遺傳因素，本研究

15、為CBZ治療方案優(yōu)化和癲癇患者個(gè)體化給藥提供了有價(jià)值的信息。
　　第三章：基因多態(tài)性對(duì)奧卡西平藥動(dòng)學(xué)的影響。
　　目的：奧卡西平(Oxcarbazepine，OXC)作為第二代抗癲癇藥物，是卡馬西平的一種10-酮類(lèi)衍生物。盡管OXC的化學(xué)結(jié)構(gòu)與CBZ相似，并有共同的作用靶點(diǎn)——鈉離子通道。但兩者在藥代動(dòng)力學(xué)、療效和不良反應(yīng)等方面均存在差異。OXC經(jīng)胃腸道吸收后，在芳香基酮降解酶作用下代謝為其中間代謝產(chǎn)物羥基衍生物10，11-

16、二氫-10-羥基卡馬西平（monohydroxy carbamazepine，MHD）， MHD是OXC產(chǎn)生抗癲癇作用的主要化合物。OXC和MHD的主要清除途徑是在葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶(UDP-glucuronosyhransferase，UGT)的作用下，形成葡萄糖醛酸結(jié)合物隨尿排出。此外， ATP結(jié)合盒(ATP-binding cassette，ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)體也參與OXC的體內(nèi)過(guò)程，多藥耐藥相關(guān)蛋白2（multiple resista

17、nce-associated protein2，MRP2）又稱(chēng)ABCC2，是轉(zhuǎn)運(yùn)體亞家族之一。編碼上述靶點(diǎn)、代謝酶和轉(zhuǎn)運(yùn)體的SCN1A/2A、UGT和ABCC2具有基因多態(tài)性。我們推測(cè)其多態(tài)性可能影響OXC的體內(nèi)過(guò)程，從而導(dǎo)致藥動(dòng)學(xué)上的差異。本研究的目的是考察S CN1 A/2A、UGT2B7和ABCC2基因多態(tài)性對(duì)中國(guó)漢族癲癇患者OXC藥動(dòng)學(xué)的影響。
　　方法：收集OXC單藥治療的中國(guó)漢族癲癇患者，使用OXC維持劑量8周以上，血

18、藥濃度達(dá)穩(wěn)態(tài)。在早上7點(diǎn)到9點(diǎn)服藥之前采集外周靜脈血2 ml，采用高分辨率熔解曲線法檢測(cè)SCN1A c.3184A＞G、SCN2A c.56G＞A和IVS7-32A＞G、ABCC23972C＞T和c.1249 G＞A、UGT2B7 c.802T＞C的基因分型，Taqman探針?lè)z測(cè)SCN1AIVS5-91G＞A基因分型。MHD穩(wěn)態(tài)血藥濃度采用第一部分的HPLC方法進(jìn)行測(cè)定。并以MHD濃度/（日劑量/體重）為校正濃度CDR(Concent

19、ration-Dose ratios)，CDR取自然對(duì)數(shù)后，成正態(tài)分布，采用單因素分析法(ANOVA)和多元線性回歸法，考察基因多態(tài)性及性別、年齡、起病年齡、病程等臨床混雜因素對(duì)癲癇患者維持劑量(Maintenance Dose，mg/kg/day)和校正濃度InCDRs的影響。
　　結(jié)果：⑴MHD穩(wěn)態(tài)血藥濃度和維持劑量(Dose/Weight)的相關(guān)性分析穩(wěn)態(tài)血藥濃度和維持劑量(Dose/Weight)的相關(guān)系數(shù)r=0.583，

20、p＜0.001，可以認(rèn)為MHD穩(wěn)態(tài)血藥濃度和維持劑量成正相關(guān)。⑵184例癲癇患者中，SCN基因4個(gè)突變位點(diǎn)SCN1A IVS5-91G＞A、SCN1Ac.3184A＞G、SCN2Ac.56G＞A和SCN2AIVS7-32A＞G的變異頻率分別為43.2％、9.2％、13.9％和10.9％。UGT2B7 c.802T＞C、ABCC23972C＞T和c.1249 G＞A的變異頻率分別為66.0％、12.0％和10.5％。連鎖分析顯示SCN1A

21、IVS5-91G＞A和c.3184A＞G，SCN2Ac.56G＞A和IVS7-32A＞G位點(diǎn)存在較高程度的連鎖，D'值分別為0.95和0.99。SCN1A/2A的4個(gè)位點(diǎn)構(gòu)建得到頻率大于3％的7種單倍體。⑶攜帶SCN1AIVS5-91G＞A、UGT2B7 c.802T＞C、ABCC2 c.1249 G＞A突變基因的患者需要較高的OXC維持劑量(mg/kg/day)。SCN1AIVS5-91 AA型的患者比GG型和GA型患者需要更高劑量的

22、OXC（16.95±6.56 vs14.54±4.74，p=0.007，14.42±5.18 vs16.95±6.56，P=0.046）。UGT2B7 c.802 CC型和CT型患者比TT型患者需要更高劑量的OXC(12.14±3.49 vs16.15±6.10,P=0.007;12.14±3.49 vs15.11±5.48,P=0.042)。ABCC2 c.1249 AA型和GA型患者比GG型患者需要更高劑量的OXC（14.63±5.

23、25 vs25.66±10.17，P=0.006;14.63±5.25vs16.98±6.27，P=0.018）。SCN1AIVS5-91三種基因型患者OXC的lnCDR(day/ml)依次降低，GG＞GA＞AA，并存在顯著性差異（2.90±0.29vs2.88±0.34 vs2.75±0.21，P＜0.05）。多因素分析的結(jié)果提示SCN1A IVS5-91G＞A影響校正濃度lnCDRs，不同基因間lnCDRs存在顯著性相關(guān)。未發(fā)現(xiàn)其他

24、SNPs對(duì)OXC維持劑量(Maintenance Dose)和校正濃度InCDRs的影響。
　　結(jié)論：研究提示SCN1A、UGT2B7、ABCC2基因多態(tài)性是影響OXC的維持劑量和lnCDRs的遺傳因素，為OXC治療方案優(yōu)化和癲癇患者個(gè)體化給藥提供了有價(jià)值的信息。
　　第四章：SCN1A/2A和ABCC2基因多態(tài)性在癲癇患者中的分布及其與癲癇耐藥的相關(guān)性研究。
　　目的：研究發(fā)現(xiàn)盡管正規(guī)使用抗癲癇藥物(antiepil

25、eptic drugs，AEDs)仍大約有三分之一的癲癇患者治療失敗，這種對(duì)AEDs產(chǎn)生耐受現(xiàn)象的特點(diǎn)是患者對(duì)多種抗癲癇藥物產(chǎn)生多重耐藥，其耐藥原因和機(jī)制尚不完全清楚，以往的研究表明P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)、多藥抗藥性相關(guān)蛋白(multidrug resistance-associated protein，MRPs)的過(guò)度表達(dá)和藥物作用靶點(diǎn)鈉離子通道、GABA受體亞基改變是產(chǎn)生癲癇耐藥的主要原因。ABCC2和

26、SCN1A/2A是編碼MRP2和鈉離子通道的基因，具有多態(tài)性。本研究為探索中國(guó)漢族癲癇患者SCN1A/2A和ABCC2基因多態(tài)性及其單倍體與AEDs耐藥的關(guān)系。
　　方法：收集中國(guó)漢族癲癇患者的臨床資料，癲癇患者按照以下標(biāo)準(zhǔn)分為耐藥組和藥物反應(yīng)組。耐藥組(drug-resistant):正確選擇和使用抗癲癇藥物，以最大耐受量使用過(guò)兩種以上的AEDs（包括單藥和聯(lián)合用藥），一年內(nèi)癲癇發(fā)作大于4次;藥物反應(yīng)組(drug-respons

27、ive):正確選擇和使用抗癲癇藥物，一年無(wú)發(fā)作，或至少經(jīng)過(guò)三個(gè)發(fā)作周期無(wú)發(fā)作（無(wú)論發(fā)作周期的長(zhǎng)短）。采靜脈血2mL，提取DNA，采用高分辨率熔解曲線法檢測(cè) SCN1A c.3184A＞G、SCN2A c.56G＞A和IVS7-32A＞G、ABCC23972C＞T和c.1249 G＞A的基因分型，Taqman探針?lè)z測(cè)SCN1AIVS5-91G＞A基因分型。應(yīng)用基于最大似然(expectation maximization)算法的SHEs

28、is軟件進(jìn)行單體型構(gòu)建，采用Binarylogistic回歸模型評(píng)估基因型及單體型與癲癇耐藥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)程度，并計(jì)算比數(shù)比(odd ratios，ORs)及95％可信區(qū)問(wèn)(confidence interval, CI)。
　　結(jié)果：共計(jì)納入453例癲癇患者（男性258例.女性195例），耐藥組246例，藥物反應(yīng)組207例。SCN1A IVS5-91 G＞A的AA基因型與耐藥顯著相關(guān)，OR=3.41(1.73-6.70)，p＜0

29、.001;等位基因A與耐藥顯著相關(guān)，OR=1.52(1.17-1.98)，p=0.002。ABCC2 c.1249G＞A的GA基因型與耐藥顯著相關(guān)，OR=2.14(1.23-3.71)，p=0.007，等位基因A與耐藥顯著相關(guān)，OR=2.05(1.31-3.19)，p=0.001。在兩組中SCN1Ac.3184A＞G、SCN2A c.56G＞A和IVS7-32A＞G和ABCC23972C＞T基因型未有顯著性差異。在連鎖不平衡分析中SCN

30、1A IVS5-91G＞A和SCN1A c.3184A＞G之間存在連鎖（D'值=0.899），SCN2Ac.56G＞A和SCN2A IVS7-32A＞G之間存在連鎖(D'=0.991)。單倍體AAGA的頻率(SCN1A IVS5-91G＞A/SCN1A c.3184A＞G/SCN2A c.56G＞A/SCN2A IVS7-32A＞G)在耐藥組顯著高于藥物反應(yīng)組(43.3％ vs34.3％，p=0.006)。單倍體AAGG的頻率在耐藥組顯

31、著高于藥物反應(yīng)組(8.2％ vs4.7％，p=0.036)。
　　結(jié)論：SCN1A IVS5-91G＞A和ABCC2 c.1249 G＞A基因多態(tài)性、單倍體AAGA和AAGG(SCN1A IVS5-91G＞A/SCN1A c.3184A＞G/SCN2A c.56G＞A/SCN2A IVS7-32A＞G)與抗癲癇藥物耐藥顯著相關(guān)，并未發(fā)現(xiàn)SCN1A c.3184A＞G、SCN2A c.56G＞A、IVS7-32A＞G和ABCC239