乙型肝炎表面抗原主蛋白與烯酰輔酶A水合酶相互作用對細胞脂代謝影響的研究.pdf

1、目的：
　　通過在人肝癌細胞株HepG2中瞬時轉(zhuǎn)染乙型肝炎表面抗原主蛋白（small hepatitis b surface antigen，SHBs），觀察SHBs與烯酰輔酶A水合酶(enoyl Coa hydratase，ECHS1)相互作用對細胞生長和細胞內(nèi)脂質(zhì)代謝的影響，初步探導(dǎo)SHBs與ECHS1相互作用在慢性乙型肝炎（chronic hepatitis b，CHB）患者發(fā)生肝脂肪變中的可能作用。為未來CHB合并脂肪肝分

2、子機制的進一步研究提供實驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.以pcDNA3.1(+)質(zhì)粒為載體構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-SHBs和pcDNA3.1(+)-ECHS1。
　　2.建立SHBs瞬時轉(zhuǎn)染細胞模型：將 pcDNA3.1(+)-SHBs通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)入HepG2細胞中，同時設(shè)立未轉(zhuǎn)染HepG2細胞和轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒pcDNA3.1(+)作為對照，24h后通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse tran

3、scription polymerase reaction，RT-PCR)法驗證轉(zhuǎn)染組細胞內(nèi)SHBs的表達。
　　3.設(shè)計并合成針對ECHS1的siRNA序列插入到pSilencer載體中，通過脂質(zhì)體將插入ECHS1-siRNA陰性對照序列的pSilencer、pcDNA3.1(+)-ECHS1、插入了有效ECHS1干擾序列的pSilencer分別轉(zhuǎn)入已成功表達SHBs基因的HepG2細胞中，同時設(shè)立未轉(zhuǎn)染HepG2細胞、轉(zhuǎn)染空載

4、質(zhì)粒HepG2細胞和單純轉(zhuǎn)染SHBs的HepG2細胞作為對照。
　　4.轉(zhuǎn)染后48h用半定量RT-PCR和Western Blot分別從mRNA水平和蛋白質(zhì)水平檢測 ECHS1及脂代謝相關(guān)基因的表達情況，并測定各轉(zhuǎn)染組細胞培養(yǎng)液中的轉(zhuǎn)氨酶水平和細胞內(nèi)總膽固醇（total cholesterol，TC）及甘油三酯（triglyceride，TG）的含量，油紅O染色觀察細胞內(nèi)脂滴蓄積情況。
　　結(jié)果：
　　1.成功建立He

5、pG2細胞SHBs的瞬時轉(zhuǎn)染模型
　　2.與未轉(zhuǎn)染HepG2細胞相比，單純SHBs轉(zhuǎn)染組及SHBs+ECHS1-siRNA陰性序列對照組在核酸水平ECHS1、LPL、ApoA1表達分別下降，ACC表達升高，PPARα和CPT1A表達無明顯變化，蛋白水平的上述基因的表達趨勢同核酸基本一致，細胞培養(yǎng)液中轉(zhuǎn)氨酶升高，細胞內(nèi)膽固醇含量升高，甘油三酯含量下降。
　　3.相比單純SHBs轉(zhuǎn)染組：在轉(zhuǎn)染了SHBs的HepG2細胞中過表達E

6、CHS1可在核酸和蛋白水平上調(diào)LPL的表達（P<0.05），下調(diào)ApoA1、ACC和CPT1A的表達(P<0.05)，而對PPARα的表達無影響(P>0.05)；且細胞培養(yǎng)液中轉(zhuǎn)氨酶水平、細胞內(nèi)TC及TG含量均下降。
　　4.相比單純 SHBs轉(zhuǎn)染組：在轉(zhuǎn)染了 SHBs的HepG2細胞中靶向下調(diào)ECHS1可在核酸水平下調(diào)LPL和ApoA1，上調(diào)ACC、CPT1A表達，但ApoA1表達要高于ECHS1過表達組，而PPARα表達無明顯