USP22 ShRNA慢病毒載體的構(gòu)建及其干擾人鼻咽癌細(xì)胞CNE-2的研究.pdf

1、目的：構(gòu)建并鑒定USP22 ShRNA慢病毒載體，成功感染人鼻咽癌細(xì)胞，研究其對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞中USP22基因表達(dá)的抑制效率，建立USP22 shRNA慢病毒載體穩(wěn)定干擾細(xì)胞系，為進(jìn)一步研究 USP22基因在鼻咽癌中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　方法：針對(duì)USP22基因的編碼序列設(shè)計(jì)并合成2條特異性干擾序列，序列兩端含有限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)HpaI和XhoI。寡核苷酸鏈退火生成寡核苷酸雙鏈，5’端磷酸化后將含有酶切位點(diǎn)的寡核苷酸雙鏈克隆到

2、pLL3.7慢病毒表達(dá)載體。連接產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)，提取其質(zhì)粒，提取出來的質(zhì)粒經(jīng)HpaI和XhoI酶切電泳鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。構(gòu)建成功的慢病毒表達(dá)載體pLL-USP22-shRNA與包裝載體質(zhì)?；靹蚬厕D(zhuǎn)染于293T細(xì)胞。通過熒光顯微鏡下觀察GFP情況，對(duì)病毒滴度和感染效率進(jìn)行檢測(cè)。在適合的感染復(fù)數(shù)條件下，將包裝成功的慢病毒原液感染至人鼻咽癌細(xì)胞。通過實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR及Western blot檢測(cè)感染前后USP22基因及蛋

3、白表達(dá)水平的變化，得到干擾抑制USP22基因表達(dá)的效率。
　　結(jié)果：成功構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體 pLL-USP22-shRNA，通過限制性內(nèi)切酶HpaI和XhoI酶切電泳和測(cè)序鑒定結(jié)果正確。慢病毒表達(dá)載體與包裝載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后測(cè)定慢病毒滴度為4×107TU/ml，說明病毒轉(zhuǎn)染成功，適合感染目的細(xì)胞。在感染復(fù)數(shù)50的條件下，慢病毒感染至人鼻咽癌細(xì)胞CNE-2的感染效率大于95％。通過實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR及 Wester