不同化療模式對卵巢癌裸鼠移植瘤中CD133表達的影響.pdf

1、卵巢上皮性癌（epithelial ovarian cancer，EOC）（以下簡稱為卵巢癌）是惡性腫瘤的第五大殺手，在婦科惡性腫瘤中死亡率居于首位[1]。標準的治療模式是徹底的腫瘤細胞減滅術合并鉑類為基礎的化療方案，但較高的耐藥性和不可避免的復發(fā)對傳統(tǒng)的最大耐受劑量間斷化療的模式，即MTD(maximum tolerated dose)模式發(fā)出挑戰(zhàn)[2]。而我們首先要做的是尋找腫瘤耐藥、復發(fā)的根源。
　　近年來，研究發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤

2、的生長、轉移、化療耐藥和復發(fā)與腫瘤干細胞(cancer stem cell，CSC)密切相關。在實驗腫瘤學方面，目前CSC的定義:可自我更新或再生的部分惡性細胞，可成功地異種移植并呈現(xiàn)與原腫瘤相同的具有異質性的細胞表面標志物或表型[3]。通常情況下化療能夠殺滅大多數(shù)增殖狀態(tài)的腫瘤細胞，殘存CSCs能夠充填原來的空缺，形成新的瘤灶[4]。然而CSCs的子細胞也可遺傳CSCs的耐藥性特征，導致復發(fā)癌的化療低反應。研究證實CSCs的數(shù)目與腫瘤

3、難治性成正比[5]。一系列動物實驗已證明MTD化療模式能富集CSCs[6]，為復發(fā)埋下隱患。因此，我們推測，減少殘存腫瘤中的CSCs，使原有的無分化潛能的腫瘤細胞處于主要地位，能夠有效地保持化療的敏感性，可能成為抵抗耐藥、降低復發(fā)率、改善預后的突破口。
　　低劑量持續(xù)化療(low-dose metronomic chemotherapy，LDM)作為一種新的化療模式于2000年由Browder等[7]首次提出并得到關注。胰腺癌、腦

4、膠質瘤等異體移植瘤實驗中發(fā)現(xiàn)LDM化療后腫瘤中CSCs比率減少[8]。因此，LDM為基礎的化療模式可能對CSCs針對性治療更有效，有望為臨床卵巢癌治療提供新思路。
　　目的:
　　1 CSCs是導致化療后腫瘤耐藥、復發(fā)的根源。本研究通過對裸鼠荷人卵巢癌SKOV3模型模擬進行順鉑MTD及LDM模式化療，檢測不同化療模式對卵巢上皮性癌CSCs樣細胞的影響，以期為臨床治療提供新思路。
　　2本研究應用CD133單克隆抗體進行

5、細胞分選，并測定CD133陽性細胞的干細胞特性，進而探討CD133作為卵巢癌CSCs標記物的可行性。
　　方法:
　　1建立裸鼠異種移植瘤模型并進行不同模式化療，定時監(jiān)測腫瘤生長情況及化療副反應。
　　將卵巢上皮性癌SKOV3細胞1×107個，0.2 ml無血清培養(yǎng)基重懸，接種于16-18 g雌性裸鼠右側的大腿皮下，建立皮下異種移植瘤模型。2-3周后，當移植瘤體積達150-200mm3時，將裸鼠隨機分為三組即MTD組、

6、LDM組、對照組。MTD組給予順鉑3 mg/kg腹腔注射，3天為1周期，共6個周期;LDM組1 mg/kg連續(xù)化療18天;對照組給予等量生理鹽水。
　　每天腹腔注射前稱重裸鼠，每3天測量并記錄移植瘤的體積、食量，每6天抽取尾靜脈血檢測白細胞。同時在實驗過程中，密切觀察化療對裸鼠的副反應，包括體重的下降、食量減少、白細胞減少情況、行為和飲食的變化以及皮膚顏色的改變。
　　2流式細胞分選術分離并獲得CD133陽性細胞和陰性細胞。

7、
　　化療結束后3-7天，獲得三組腫瘤原代細胞。采用CD133熒光抗體標記后細胞表現(xiàn)出不同的熒光強度，經(jīng)過流式細胞分選術分離獲得兩群細胞，即:熒光較強的細胞群（定義為CD133陽性細胞）和熒光相對較弱的細胞群（CD133陰性細胞）。
　　3測定CD133陽性細胞的部分CSCs樣特性。
　　3.1體外克隆形成實驗觀察分選所得CD133陽性及CD133陰性細胞克隆形成率。
　　由于流式細胞分選后所得CD133陽性細胞

8、數(shù)目較少，且一部分在實驗中受損失去活性，本實驗將三組細胞所得CD133陽性細胞混合培養(yǎng)，3天后細胞換液并選取活性好的貼壁細胞進行體外克隆形成實驗，CD133陰性細胞給予相同處理。兩種細胞同時接種于6孔板，每種細胞3個孔，待出現(xiàn)肉眼可見克隆時終止實驗，重復試驗3次，比較兩種細胞克隆形成情況，并計算各自的克隆形成率。
　　3.2 Western blot方法檢測CD133陽性細胞與CD133陰性細胞中乳腺癌耐藥相關蛋白(BCRP)的表

9、達。
　　應用Western blot方法檢測蛋白，細胞數(shù)目至少達105，而流式細胞分選所得CD133陽性細胞較少，不足以分組進行蛋白測定，因此將3組腫瘤細胞分選后所得CD133陽性細胞直接混合后提取蛋白進行BCRP和下面所述的Ki-67蛋白的測定。CD133陰性細胞同樣混合后實驗。每組實驗重復3次。
　　3.3 Western blot方法檢測CD133陽性細胞與CD133陰性細胞中的Ki-67蛋白的表達。
　　4統(tǒng)

10、計學方法:采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，計量資料以均數(shù)±標準差表示，方差齊性檢驗，三組以上采用方差分析，組間差異采用LSD法，兩組數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，以α=0.05為檢驗水準，當P＜0.05時，差異有統(tǒng)計學意義;當P＞0.05時，差異無統(tǒng)計學意義。
　　結果:
　　1 LDM較MTD模式化療更明顯地抑制腫瘤生長，且副反應可耐受。
　　將SKOV3細胞1×107個接種于30只雌性裸鼠右側大腿皮下，成瘤率為10

11、0％，2-3周后當移植瘤體積150-200mm3時，將裸鼠隨機分為三組:MTD組、LDM組、對照組，移植瘤平均體積差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)?；熃Y束時，統(tǒng)計三組移植瘤平均體積分別為564.72±43.89 mm3、382.25±28.09 mm3、782.01±34.24mm3，兩兩之間差異均有統(tǒng)計學意義。根據(jù)公式，抑瘤率=（對照組移植瘤平均體積-實驗組移植瘤平均體積）/對照組移植瘤平均體積×100％,計算抑瘤率:MTD組抑瘤率

12、為27.78％，LDM組抑瘤率為51.12％。表明LDM化療較MTD模式對于腫瘤生長的抑制更有效。
　　化療過程中，MTD組和LDM組與對照組比較，裸鼠均出現(xiàn)體重減輕(P＜0.05)、食量減少(P＜0.05)、白細胞減少(P＜0.05)、精神萎靡等副反應，但根據(jù)化療副反應的分級，化療副反應屬于Ⅰ級，表明裸鼠能夠一定程度的耐受化療。LDM組較MTD組化療副反應未發(fā)現(xiàn)明顯差異，上述指標在兩組數(shù)據(jù)統(tǒng)計中均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。<

13、br>　　2 MTD化療能富集腫瘤中的CD133陽性細胞，而LDM化療則降低其在腫瘤中的表達。
　　流式細胞分選術檢測CD133陽性細胞在LDM組腫瘤中所占比率（0.247％±0.021％），明顯低于對照組（0.413％±0.021％，P=0.001）。而MTD組CD133陽性細胞比率為（1.463％±0.208％）較對照組顯著升高(P=0.000)。結果表明，傳統(tǒng)的MTD化療能富集CD133陽性細胞，而LDM模式則顯著降低其表達

14、。
　　3 CD133陽性細胞表現(xiàn)出部分CSCs樣特性。
　　3.1 CD133陽性細胞較CD133陰性細胞顯示較強的克隆形成能力。
　　應用體外平板克隆實驗比較CD133陽性細胞和CD133陰性細胞的克隆形成能力:將兩種細胞制備單細胞懸液，接種至6孔板中，每種細胞3孔，每孔接種500個細胞，2-3周后出現(xiàn)肉眼可見的細胞克隆時終止培養(yǎng)，鏡下計數(shù)細胞數(shù)＞30個的克隆球。重復實驗3次。
　　克隆形成率(％)=克隆數(shù)/

15、接種細胞數(shù)×100％，統(tǒng)計CD133陽性細胞的克隆形成率(49.8％±2.03％)顯著高于CD133陰性細胞（3.31％±0.61％，P=0.00）。結果表明，CD133陽性細胞具有更強的克隆形成能力，這也是CSC鑒定的一個重要條件。
　　3.2 CD133陽性細胞較CD133陰性細胞耐藥性強。
　　耐藥蛋白BCRP能獨立或聯(lián)合經(jīng)典耐藥蛋白P-糖蛋白(P-gp)、多重耐藥蛋白(MRP)介導多藥耐受。Western blot結

16、果顯示，耐藥蛋白BCRP在CD133陽性細胞中表達（0.677±0.032）顯著高于CD133陰性細胞(0.228±0.018, P＜0.05)。
　　3.3 CD133陽性細胞增殖活性較CD133陰性細胞差。
　　Ki-67是一種增殖細胞相關的核抗原，在細胞增殖中不可或缺，只表達于增生的細胞，靜止的細胞中不表達，通過檢測Ki-67蛋白了解惡性腫瘤的細胞增殖活性。
　　Western blot檢測Ki-67蛋白在兩種細

17、胞中的表達結果:CD133陽性細胞（0.215±0.001）vs陰性細胞（0.739±0.009），P＜0.05。提示CD133陽性細胞較陰性細胞增殖活性差，符合CSCs的休眠的存在狀態(tài)的特性。
　　結論:
　　1順鉑LDM模式化療較傳統(tǒng)MTD化療能顯著減緩裸鼠移植瘤的生長，并能耐受化療副反應。
　　2 CD133陽性細胞表現(xiàn)出部分的CSC樣特性。
　　3順鉑LDM模式化療可降低卵巢癌移植瘤中CSC樣細胞的比率，