鹽酸右美托咪定預處理對大鼠腸缺血再灌注后肺損傷的作用及機制研究.pdf

1、研究目的：
　　1.觀察鹽酸右美托咪定預處理對大鼠腸缺血再灌注后肺損傷的作用及對炎性因子的影響;
　　2.研究鹽酸右美托咪定預處理是否通過α2受體在大鼠腸缺血再灌注后急性肺損傷中發(fā)揮作用，為鹽酸右美托咪定預處理在臨床中的使用提供新的實驗和理論基礎。
　　3.探討TLR4/MyD88和PI3K/Akt信號通路在鹽酸右美托咪定預處理對大鼠腸缺血再灌注后急性肺損傷影響中的作用，了解鹽酸右美托咪定作用的分子生物學機制。

2、　　研究方法：
　　1.鹽酸右美托咪定預處理對大鼠腸缺血再灌注后急性肺損傷的作用研究。建立在體大鼠腸缺血再灌注模型，以血氣分析、肺濕干重比值、肺組織病理變化、支氣管肺泡灌洗液炎性因子變化為指標探討不同劑量鹽酸右美托咪定預處理對大鼠腸I/R后急性肺損傷的作用。健康雄性大鼠48只，隨機分為4組:假手術組(Sham)、腸缺血再灌注組(IR)、鹽酸右美托咪定2.5ug/(kg·h)預處理組(DL)、鹽酸右美托咪定5ug/(kg·h)預處理

3、組(DH)。Sham組只開腹不阻斷小腸腸系膜上動脈，IR組尾靜脈以1.5ml/h速度輸注生理鹽水1小時后用無創(chuàng)血管夾阻斷腸系膜上動脈1h，然后開放無創(chuàng)血管夾再灌注2h。鹽酸右美托咪定預處理組(DL、DH)于小腸缺血前分別以2.5ug/(kg·h)和5ug/(kg·h)輸注速度尾靜脈持續(xù)輸注1小時鹽酸右美托咪定。腸缺血再灌注期間，所有實驗大鼠尾靜脈以1.5ml/h速度輸注生理鹽水至再灌注結(jié)束。實驗結(jié)束后，左室抽血測定動脈血氣，右室放血處死

4、實驗動物。然后，每組隨機取6只大鼠進行主支氣管灌洗，ELISA測定支氣管肺泡灌洗液中TNF-α和IL-6濃度變化;每組其余6只結(jié)扎切取右中肺測定濕干重比值，并用30ml冷生理鹽水灌肺，取右肺上葉以4％多聚甲醛固定做HE切片進行病理檢查。
　　2.α2腎上腺素受體在鹽酸右美托咪定預處理對大鼠腸缺血再灌注后急性肺損傷影響中作用。健康雄性大鼠48只，隨機分為4組:腸缺血再灌注（IR）組、鹽酸右美托咪定預處理(DH)組、鹽酸育亨賓+鹽酸右

5、美托咪定預處理(YD)組、鹽酸育亨賓預處理(Y)組。IR組尾靜脈以1.5ml/h速度持續(xù)輸注生理鹽水1小時后用無創(chuàng)血管夾阻斷腸系膜上動脈1h，然后開放無創(chuàng)血管夾再灌注2h。DH組于小腸缺血前以5ug/(kg·h)速度尾靜脈持續(xù)輸注鹽酸右美托咪定1小時。YD組于小腸缺血前尾靜脈緩慢注射鹽酸育亨賓1mg/kg(大于15min)，然后以5ug/(kg·h)速度持續(xù)輸注鹽酸右美托咪定1h。Y組于小腸缺血前尾靜脈緩慢注射鹽酸育亨賓1mg/kg（大

6、于15min），然后以1.5ml/h速度持續(xù)輸注生理鹽水1小時。腸缺血再灌注期間，所有實驗大鼠尾靜脈以1.5ml/h速度輸注生理鹽水至再灌注結(jié)束。實驗結(jié)束后，左室抽血測定動脈血氣，右室放血處死實驗動物。檢測指標及方法同第一部分。
　　3.TLR4/MyD88/NF-κB和PI3K/Akt信號通路在大鼠腸缺血再灌注肺損傷中的作用。健康雄性大鼠36只，隨機分為6組:假手術組（Sham）、腸缺血再灌注組(IR)、鹽酸右美托咪定2.5ug

7、/(kg·h)預處理組(DL)、鹽酸右美托咪定5ug/(kg·h)預處理組(DH)、鹽酸育亨賓+鹽酸右美托咪定預處理(YD)組、鹽酸育亨賓預處理(Y)組。給藥方法同第一、二部分，并建立大鼠腸缺血再灌注模型。實驗結(jié)束后，右室放血處死實驗動物，取部分肺組織以熒光實時定量PCR測定TLR4 mRNA和MyD88 mRNA的表達，Western blotting測定IκBα、磷酸化IκBα、Akt和磷酸化Akt蛋白表達。
　　研究結(jié)果：<

8、br>　　1.假手術(Sham)組、腸缺血再灌注(IR)組、不同劑量鹽酸右美托咪定預處理(DL、DH)組，于再灌注后組間比較動脈血氣(pHa、PaO2、PaCO2)，結(jié)果差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。HE病理結(jié)果顯示，Sham組肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺泡腔內(nèi)見少量滲出，毛細血管未見明顯充血和（或）出血;IR組腸缺血再灌注造成明顯肺損傷，肺泡結(jié)構(gòu)破壞明顯，肺泡壁明顯增厚，肺間質(zhì)和肺泡出血水腫并有大量炎性細胞浸潤;DL和DH組肺組織病理改變均

9、較IR組明顯減輕，肺間質(zhì)和肺泡腔內(nèi)滲出明顯減少，但仍見有部分肺泡結(jié)構(gòu)存在一定程度破壞，部分肺泡間隔略增厚，少量炎性細胞浸潤。各組肺組織病理評分結(jié)果和病理切片HE染色結(jié)果趨勢具有一致性，DL、DH組與IR組比較，病理評分和肺濕干重比值均明顯降低(P＜0.05)。DL和DH組支氣管肺泡灌洗液中TNF-α和IL-6濃度明顯比IR組降低(P＜0.01)。DH組與DL組比較，不僅病理評分和肺濕干重比值進一步降低，支氣管肺泡灌洗液中TNF-α和IL

10、-6濃度也進一步降低(P＜0.01)。
　　2.腸缺血再灌注(IR)組、鹽酸右美托咪定預處理(DH)組、鹽酸育亨賓+鹽酸右美托咪定預處理(YD)組、鹽酸育亨賓預處理(Y)組間比較動脈血氣(pHa、PaO2、 PaCO2)結(jié)果無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。肺濕干重比較，DH和YD組與IR組比較，明顯降低(p＜0.05)，YD組肺濕干重比值明顯高于DH組(P＜0.01)，而Y組與IR組的肺濕干重比值比較無明顯差異(P＞0.05)。HE

11、病理切片顯示，IR組和Y組具有明顯肺損傷，肺泡結(jié)構(gòu)破壞明顯，肺泡壁明顯增厚，肺間質(zhì)和肺泡出血水腫并有大量炎性細胞浸潤;DH組肺組織病理改變均較IR組明顯減輕。YD組肺組織具有中度的損傷，肺泡結(jié)構(gòu)破壞明顯，肺泡壁增厚，部分肺間質(zhì)和肺泡出血水腫并有炎性細胞浸潤。各組肺組織病理評分比較，DH和YD組與IR組比較，均明顯降低(P＜0.01);YD組明顯高于DH組(P＜0.01)，而Y組和IR組無明顯差異(P＞0.05)。支氣管肺泡灌洗液(BAL

12、F)中炎性因子的測定結(jié)果顯示，與IR組比較，DH和YD組BALF中TNF-α和IL-6濃度明顯降低(P＜0.01);與DH組比較，YD組TNF-α和IL-6濃度明顯升高(P＜0.01)。Y組與IR組比較， BALF中TNF-α和IL-6濃度無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　3.免疫熒光定量PCR和蛋白印跡結(jié)果顯示，IR組肺組織的TLR4mRNA、MyD88mRNA、磷酸化IκBα較Sham組表達明顯增加(P＜0.01)，而IR組

13、Akt的磷酸化與Sham組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。鹽酸右美托咪定預處理(DL、DH)組、鹽酸育亨賓+鹽酸右美托咪定預處理(YD)組與IR組比較肺組織TLR4、MyD88mRNA、磷酸化IκBα表達均減少(P＜0.01)，磷酸化Akt增加(P＜0.01);與DH組比較，YD和DL組肺組織TLR4、MyD88 mRNA、磷酸化IκBα表達均增加(P＜0.01)，磷酸化Akt減少(P＜0.01);而Y組與YD組比較肺組織TLR4

14、、MyD88 mRNA、磷酸化IκBα表達增加(P＜0.01)，磷酸化Akt減少(P＜0.01)。單純鹽酸育亨賓預處理組，腸缺血再灌注后肺組織的TLR4mRNA、MyD88mRNA表達、磷酸化IκBα及Akt的磷酸化與IR組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　實驗結(jié)論：
　　1.鹽酸右美托咪定預處理能改善腸缺血再灌注造成的急性肺損傷和炎癥反應，這種保護作用可能具有劑量依賴性。
　　2.鹽酸右美托咪定可能部分通過α2