右美托咪定對(duì)腎缺血-再灌注（缺氧-復(fù)氧）損傷的保護(hù)作用及部分機(jī)制.pdf

1、背景：
　　右美托咪定(Dex)做為一個(gè)高效、高選擇的α2受體激動(dòng)劑，由于其具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗炎和利尿等積極作用，同時(shí)無明顯的呼吸抑制及腦電干擾等副作用，目前在臨床中以麻醉輔助用藥的身份得到了廣泛的應(yīng)用，在心臟手術(shù)中，Dex表現(xiàn)出了能夠減少麻醉藥物的需要量，增強(qiáng)血液動(dòng)力學(xué)的穩(wěn)定性和提供心臟手術(shù)后患者的鎮(zhèn)靜作用等方面的優(yōu)勢(shì)。隨著Dex在心臟手術(shù)中的廣泛應(yīng)用，Dex表現(xiàn)出可以降低CPB下心臟手術(shù)患者的術(shù)后肺損傷和腦損傷的發(fā)生率及減輕術(shù)

2、后肺損傷和腦損傷的程度。然而，Dex對(duì)CPB下心臟手術(shù)患者的腎保護(hù)作用的安全性和有效性仍存在爭(zhēng)議。Sugita S等報(bào)道在動(dòng)物模型中，Dex可減輕大鼠腎缺血再灌注損傷，然而Kari等卻報(bào)道在臨床中Dex僅增加了尿量，并沒有對(duì)腎臟產(chǎn)生保護(hù)作用。
　　心臟直視手術(shù)大多需要在體外循環(huán)(CPB)輔助下完成，但CPB過程中引起的小栓子脫落、非生理性灌注及炎癥反應(yīng)等可導(dǎo)致腎組織局部產(chǎn)生不同程度的缺血，再灌注被認(rèn)為是缺血的必要挽救措施，但是隨著

3、研究的深入發(fā)現(xiàn)缺血后再灌注反而加重原來缺血器官的損傷，所以CPB下心臟手術(shù)后，腎臟遭受著缺血及缺血后再灌注等多重打擊，最終有可能引起術(shù)后不同程度的急性腎損傷(AKI)。腎小管上皮細(xì)胞是腎臟主要實(shí)質(zhì)細(xì)胞，與其它腎單位相比其最容易發(fā)生缺血性損傷，腎H/R損傷很容易導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞凋亡。AKI是一種發(fā)病率及死亡率極高和使醫(yī)療費(fèi)明顯增加的全球公共衛(wèi)生問題。臨床研究表明CPB下心臟瓣膜置換術(shù)是心臟手術(shù)后AKI發(fā)生的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素。實(shí)施合理的腎

4、保護(hù)策略具有重要意義，麻醉藥物的選擇和合理使用是圍術(shù)期實(shí)施腎保護(hù)策略的一個(gè)重要方面。對(duì)于CPB下心臟瓣膜置換術(shù)，這一術(shù)后高發(fā)AKI的手術(shù)類型，Dex是否具有腎保護(hù)作用，降低術(shù)后AKI的發(fā)生率尚未見報(bào)道。
　　內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER):與各種膜蛋白、分泌蛋白、和磷脂膽固醇代謝相關(guān)的真核細(xì)胞內(nèi)的最大細(xì)胞器，是細(xì)胞內(nèi)折疊蛋白的場(chǎng)所。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，E

5、RS):過度的氧化應(yīng)激、缺血再灌注和鈣離子濃度改變等病理生理改變時(shí)均可導(dǎo)致ER功能發(fā)生紊亂，細(xì)胞對(duì)ER功能的需求超過其自身能力，在ER內(nèi)出現(xiàn)未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)聚集以及Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡的病理狀態(tài)。適度的ERS是細(xì)胞的自我保護(hù)性機(jī)制，其能夠觸發(fā)哺乳類動(dòng)物真核細(xì)胞內(nèi)的一種保護(hù)性應(yīng)激反應(yīng)即未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)，最終恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)以使細(xì)胞生存;但是過強(qiáng)或過長(zhǎng)時(shí)間的ERS則可能導(dǎo)致細(xì)胞凋

6、亡或壞死，從而造成組織和器官受損。在缺血缺氧、葡萄糖缺乏、鈣濃度變化以及氧化應(yīng)激等病理情況時(shí)則能誘發(fā)ERS，這是啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的重要途徑之一。研究表明ERS參與心、腦、腎等重要器官缺血再灌注損傷的病理生理過程。但Dex對(duì)腎臟的保護(hù)作用是否與ERS途徑有關(guān)尚不清楚。
　　脂質(zhì)過氧化反應(yīng)是指機(jī)體必須的多不飽和脂肪酸在體內(nèi)氧化酶的作用下生成了一系列生物活性物質(zhì)，同時(shí)也產(chǎn)生了大量氧自由基。增高的氧自由基不僅可以直接氧化脂質(zhì)以及蛋白質(zhì)和DNA

7、等生物大分子，還可以作為信號(hào)分子引起細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)傳導(dǎo)通路的異常，導(dǎo)致人體正常細(xì)胞和組織的損壞，從而引起多種疾病。圍術(shù)期腎損傷的發(fā)病率不斷上升，以缺血再灌注腎損傷最為多見，常發(fā)生于腎移植、CPB下心臟手術(shù)后、創(chuàng)傷、失血性休克及膿毒血癥等疾病基礎(chǔ)下，有研究表明腎損傷的發(fā)病機(jī)制除了與ATP的減少、細(xì)胞凋亡基因的調(diào)控和細(xì)胞內(nèi)鈣超載外，與大量氧自由基的產(chǎn)生也有著密切關(guān)系。所以脂質(zhì)過氧化反應(yīng)過程中產(chǎn)生的大量氧自由基在缺血性腎損傷的發(fā)生發(fā)展中具有重要

8、意義，許多減輕腎缺血再灌注的因素亦可以通過抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)而發(fā)揮腎保護(hù)作用。目前，有關(guān)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)是否參與Dex對(duì)腎缺血再灌注的保護(hù)作用尚無定論。
　　目的：
　　本研究分臨床試驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)兩部分。
　　第一部分 臨床試驗(yàn)部分
　　1.通過給予CPB下瓣膜置換術(shù)患者Dex干預(yù)后，檢測(cè)患者各時(shí)點(diǎn)的血清中NGAL和尿IL-18的水平，BUN和Cr的濃度，同時(shí)記錄術(shù)中、術(shù)后1d和術(shù)后2d患者的尿量，診斷并記錄患者術(shù)

9、后AKI的發(fā)生情況，評(píng)估Dex對(duì)患者腎功能及術(shù)后AKI發(fā)生率的影響。
　　2.測(cè)定患者各時(shí)點(diǎn)的血清中MDA濃度和SOD活性，了解脂質(zhì)過氧化反應(yīng)是否參與Dex對(duì)CPB下瓣膜置換術(shù)患者腎功能的影響。
　　第二部分 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)部分
　　1.通過給予腎小管上皮細(xì)胞(HK-2細(xì)胞)Dex培養(yǎng)后，測(cè)定細(xì)胞活力及細(xì)胞凋亡率，評(píng)估Dex對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用
　　2.通過測(cè)定經(jīng)不同培養(yǎng)方式后的HK-2細(xì)胞GRP7

10、8、CHOP、caspase-12和活化caspase-3的表達(dá)水平及MDA濃度和SOD活性，探討ERS和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)在Dex腎保護(hù)作用中的潛在機(jī)制。
　　方法：
　　第一部分 臨床試驗(yàn)部分
　　右美托咪定對(duì)CPB下瓣膜置換術(shù)患者術(shù)后急性腎損傷的發(fā)生率及腎功能的影響:一項(xiàng)雙盲、隨機(jī)、對(duì)照研究
　　擇期CPB下心臟瓣膜置換術(shù)患者入選了本隨機(jī)、前瞻性、安慰劑對(duì)照和雙盲試驗(yàn)。性別不限，年齡18～65歲，ASA分級(jí)Ⅱ或

11、Ⅲ級(jí)，NYHA分級(jí)Ⅱ-Ⅲ級(jí)，采用電腦隨機(jī)數(shù)字表法，將其分為兩組:對(duì)照組（Placebo組）和右美托咪定組(Dex組)。麻醉誘導(dǎo)前Dex組靜脈注射4.0μg/ml的右美托咪定0.6μg/kg(給藥時(shí)間15min)，隨后以0.2μg·kg-1·h-1速率輸注至術(shù)畢，Pacebo組給予等容量的生理鹽水。分別于麻醉誘導(dǎo)前(T1)、手術(shù)結(jié)束時(shí)(T2)及術(shù)后12h、24h和72h(T3-5)留取頸內(nèi)靜脈血樣和尿液，采用ELISA法測(cè)定NGAL和尿I

12、L-18的水平及測(cè)定MDA濃度和SOD活性，并測(cè)定血清中尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)的濃度，同時(shí)記錄術(shù)中、術(shù)后1d和術(shù)后2d患者的尿量，記錄患者術(shù)后急性腎損傷等圍術(shù)期不良事件的發(fā)生情況。
　　第二部分 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)部分
　　內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在右美托咪定對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞凋亡中的作用
　　將培養(yǎng)成功的人腎小管上皮細(xì)胞系（HK-2細(xì)胞），采用隨機(jī)數(shù)字表法，將其分為4組(n=5):正常對(duì)照組（C組）:置于37℃常氧恒溫細(xì)

13、胞培養(yǎng)箱28h;右美托咪定組(Dex組):終濃度0.1nmol/L的Dex孵育2h，隨后置于37℃常氧恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)28h;缺氧/復(fù)氧組（H/R組）:置于37℃的厭氧培養(yǎng)罐中缺氧24h后，隨后置于37℃常氧恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行復(fù)氧4h;Dex+缺氧/復(fù)氧組（各Dex+H/R組）:用終濃度0.1nmol/L的Dex孵育2h，隨后置于37℃的厭氧培養(yǎng)罐中缺氧24h后置于37℃常氧恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行復(fù)氧4h。各組培養(yǎng)結(jié)束后采用MTT法檢

14、測(cè)細(xì)胞活力，計(jì)算細(xì)胞存活率，流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率。Western blot法檢測(cè)GRP78、CHOP、caspase-12和活化caspase-3的表達(dá)并測(cè)定細(xì)胞丙二醛(MDA)濃度和超氧化物歧化酶(SOD)活性。
　　結(jié)果：
　　第一部分 臨床試驗(yàn)部分
　　最終共有72例患者完成本項(xiàng)試驗(yàn)，兩組患者一般資料各指標(biāo)及術(shù)中情況各指標(biāo)的比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。與T1（麻醉誘導(dǎo)前）比較，兩組T5時(shí)(術(shù)后72h)血

15、清BUN和Cr的濃度升高，T3,4時(shí)(術(shù)后12h和24h)血清NGAL和尿IL-18的水平升高，T2,3時(shí)(手術(shù)結(jié)束時(shí)和術(shù)后12h)血清MDA濃度升高，SOD活性降低(P＜0.05）。與Placebo組比較，Dex組T5時(shí)(術(shù)后72h)血清BUN和Cr的濃度降低，T3,4時(shí)(術(shù)后12h和24h)血清NGAL水平降低(P＜0.05），兩組各時(shí)點(diǎn)尿IL-18水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，T2,3時(shí)(手術(shù)結(jié)束時(shí)和術(shù)后12h)血清MDA

16、濃度降低，SOD活性升高(P＜0.05)。與Placebo組比較，Dex組術(shù)中尿量增多，術(shù)后AKI的發(fā)生率明顯較Placebo組低(P＜0.05)。兩組患者術(shù)后恢復(fù)情況及其他不良事件各指標(biāo)的比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　第二部分 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)部分
　　倒置顯微鏡下，C組和Dex組細(xì)胞貼壁良好，形態(tài)正常;H/R組活細(xì)胞數(shù)減少，細(xì)胞呈水泡樣變性;Dex+H/R組細(xì)胞狀態(tài)較H/R組明顯改善。與C組比較，H/R組和Dex+

17、H/R組HK-2細(xì)胞活力降低，凋亡率升高(P＜0.05);與H/R組比較，Dex+H/R組HK-2細(xì)胞活力升高，凋亡率降低，與C組比較，H/R組和Dex+H/R組SOD活性降低，MDA濃度及GRP78、CHOP、caspase-12和活化caspase-3的表達(dá)上調(diào)(P＜0.05);與H/R組比較，Dex+H/R組SOD活性升高，MDA濃度及GRP78、CHOP、caspase-12和活化caspase-3的表達(dá)下調(diào)(P＜0.05)。<