依達(dá)拉奉預(yù)處理對(duì)大鼠腸缺血再灌注肺損傷的保護(hù)作用.pdf

1、目的：觀察依達(dá)拉奉對(duì)腸缺血再灌注肺損傷的保護(hù)作用，并探討其可能機(jī)制，為擴(kuò)展其臨床新用途提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：
　　 1、實(shí)驗(yàn)分組及動(dòng)物模型制備
　　 健康清潔級(jí)Wistar大鼠30只，雄性，月齡3～3.5月，體重250～300g（河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為3組，每組10只：假手術(shù)組（N組），缺血再灌注組（I/R組），依達(dá)拉奉預(yù)處理組（E組）。N組：暴露腸系膜上動(dòng)脈（SMA），觀察3小時(shí)

2、；I/R組：暴露SMA，動(dòng)脈夾夾閉1小時(shí)，再灌注2小時(shí)；E組：灌注前10分鐘于頸外靜脈輸注依達(dá)拉奉注射液10 mg/kg，其他同I/R組。
　　 2、檢測(cè)指標(biāo)及檢測(cè)方法
　　 2.1各組動(dòng)物的體重、月齡
　　 2.2光鏡下觀察肺組織的病理改變。
　　 N組觀察3小時(shí)，I/R組及E組再灌注2小時(shí)后，心臟抽血處死大鼠，取右肺下葉，置于4％多聚甲醛中固定，切片HE染色，在200倍光鏡下觀察肺組織的病理改變。

3、r>　　 2.3肺組織含水率
　　 N組觀察3小時(shí)，I/R組及E組再灌注2小時(shí)后，心臟抽血處死大鼠，取右肺中葉1g，吸干稱(chēng)濕重。將該組織置于60℃烤箱中烤48小時(shí)，稱(chēng)干重。肺含水率=（濕重-干重）/濕重×100％，單位為％。
　　 2.4測(cè)定肺組織丙二醛（MDA）含量及超氧化物歧化酶（SOD）活力
　　 心臟抽血處死大鼠后取左肺上葉，在冷生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，稱(chēng)重，放在勻漿管口部，在冰面上用眼科剪

4、盡快剪碎組織塊，每份樣本先加入1ml預(yù)冷生理鹽水作為勻漿介質(zhì)，用高速分散器勻漿，勻漿轉(zhuǎn)數(shù)為8000r/min，勻漿時(shí)間5秒/次，間隙30秒，連續(xù)3次，勻漿需在冰水中進(jìn)行。然后向每個(gè)樣品勻漿中補(bǔ)足剩余的冷生理鹽水，最終每個(gè)樣品加入的冷生理鹽水總量是組織塊重量的9倍，制成10％的組織勻漿。采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD，U/mgprot）活性；硫代巴比妥酸法（TBA法）檢測(cè)丙二醛（my

5、eloperoxidase，MDA，nmol/mgprot）含量。
　　 2.5酶聯(lián)免疫法測(cè)定大鼠血漿中腫瘤壞死因子-a（TNF-a）的含量
　　 頸外靜脈抽血4℃，10000r/min離心，5min后保留血漿，采用雙夾心ELISA法，按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，結(jié)果以每克蛋白所含TNF-a含量表示。
　　 2.6免疫組織化學(xué)法測(cè)定肺組織核因子-κB（NF-κB）的變化
　　 取右肺下葉，切片制作方法同光鏡標(biāo)本，

6、切片與一抗、二抗和顯色劑作用，顯色后在400倍光鏡下觀察肺組織NF-κB的陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果。
　　 2.7電子顯微鏡下觀察肺組織的超微結(jié)構(gòu)變化
　　 取上述大鼠右肺上葉切取1mm×1mm×1mm的組織塊，于4℃4％戊二醛溶液中固定1h以上，送電鏡室在透射電鏡下觀察肺組織的超微結(jié)構(gòu)。
　　 結(jié)果：
　　 1、各組動(dòng)物的體重、月齡差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）
　　 2、光鏡下觀察肺組織的病理改變

7、r>　　 N組肺泡間隔未見(jiàn)增厚，可見(jiàn)少量炎性細(xì)胞，肺泡結(jié)構(gòu)基本完整，肺泡腔清晰；I/R組肺泡間隔明顯增厚，可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及漏出的紅細(xì)胞；E組肺泡的病理改變較I/R組明顯減輕，可見(jiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡結(jié)構(gòu)較清晰。
　　 3、肺組織含水率
　　 與N組相比，I/R組肺組織含水率明顯增加（P<0.05），E組肺組織含水率增加不明顯，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與I/R組比較，E組肺組織含水率明顯減少（P<0.05）

8、。
　　 4、肺組織MDA含量
　　 與N組相比，I/R組肺組織中MDA含量明顯升高（P<0.05），E組肺組織中MDA含量升高不明顯，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與I/R組比較，E組肺組織MDA含量明顯降低（P<0.05）。
　　 5、肺組織SOD活性
　　 與N組相比，I/R組肺組織中SOD活性明顯降低（P<0.05），E組肺組織中SOD活性降低不明顯，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與I/R組比較，

9、E組肺組織SOD活性明顯升高（P<0.05）。
　　 6、酶聯(lián)免疫法測(cè)定大鼠血漿中TNF-a的含量
　　 與N組比較，I/R組血漿中TNF-a的含量明顯增高（P<0.05）；與I/R組比較，E組血漿中TNF-a的含量明顯減少（P<0.05）。
　　 7、免疫組織化學(xué)測(cè)定NF-κB的變化
　　 與N組比較，I/R組肺組織NF-κB的免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增加（P<0.05），E組肺組織NF-κB的免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)

10、增加不明顯，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與I/R組比較，E組肺組織NF-κB的免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少（P<0.05）。
　　 8、電子顯微鏡下觀察肺組織的超微結(jié)構(gòu)變化
　　 N組：肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞可見(jiàn)周?chē)⒔q毛及胞漿內(nèi)特征性的嗜餓性板層小體，細(xì)胞器，線粒體正常，氣血屏障基膜很清晰。
　　 I/R組：肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞微絨毛短小，板層小體少，細(xì)胞器減少，核周間隙擴(kuò)張，線粒體結(jié)構(gòu)髓樣化，氣血屏障3層結(jié)構(gòu)模糊不清，肺胞