新型免疫調(diào)節(jié)艾拉莫德對(duì)MRL-lpr小鼠類(lèi)狼瘡樣疾病治療作用及對(duì)其B細(xì)胞分化功能影響的研究.pdf

1、背景和目的：
　　艾拉莫德是一種新型小分子免疫調(diào)節(jié)劑，現(xiàn)在的研究已證明此藥具有多種免疫調(diào)節(jié)功能，包括:能夠抑制滑膜細(xì)胞TNF-α及單核細(xì)胞NF-κB通路、增加單核細(xì)胞膜穩(wěn)定性、抑制大鼠關(guān)節(jié)CIA發(fā)生、下調(diào)IL-17、IL-1、IL-6、IFN-γ等多種炎癥因子、抑制IL-17通路等。在本課題組和國(guó)外研究者分別完成的RA臨床試驗(yàn)中，艾拉莫德顯示出和MTX相當(dāng)?shù)寞熜Ъ鞍踩浴?br>　　前期基礎(chǔ)和臨床研究均提示艾拉莫德對(duì)體液免疫可能存

2、在抑制作用。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)艾拉莫德能夠抑制人和小鼠B細(xì)胞的免疫球蛋白產(chǎn)生、免疫重建實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)艾拉莫德可抑制RA患者滑膜組織免疫球蛋白的產(chǎn)生;臨床試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)艾拉莫德組RA患者血清免疫球蛋白和類(lèi)風(fēng)濕因子水平出現(xiàn)下降。鑒于RA和SLE具有包括自身抗體在內(nèi)的多種共同發(fā)病機(jī)制，我們推測(cè)艾拉莫德對(duì)SLE可能亦存在治療作用。
　　MRL/lpr小鼠是一種經(jīng)典的自身抗體介導(dǎo)的類(lèi)紅斑狼瘡疾病模型。它們由于MRL品系小鼠基因背景和淋巴細(xì)胞凋亡障礙的共同作

3、用而發(fā)病，在生命后期可出現(xiàn)免疫性腎炎、淋巴器官腫大、關(guān)節(jié)炎、皮損等多種改變，體內(nèi)出現(xiàn)豐富自身抗體。小鼠外周淋巴細(xì)胞出現(xiàn)多重失衡:漿細(xì)胞增多，正常T、B細(xì)胞比例因B220+T細(xì)胞累積而降低，濾泡B細(xì)胞減少而邊緣區(qū)B細(xì)胞增多，未成熟B細(xì)胞增多，等等。為進(jìn)一步驗(yàn)證我們對(duì)艾拉莫德治療SLE的猜想，本研究選擇MRL/lpr小鼠，系統(tǒng)觀察了艾拉莫德對(duì)其的治療作用，并初步探討了這個(gè)藥物在此模型中可能的作用機(jī)理。
　　材料和方法：
　　選擇

4、雌性MRL/lpr小鼠，分別隨機(jī)給藥艾拉莫得、空白載體溶液作為安慰劑或環(huán)磷酰胺作為陽(yáng)性對(duì)照。選擇不攜帶lpr基因的野生型雌性BALB/c小鼠為背景對(duì)照。
　　采用BCA法定期定量檢測(cè)小鼠尿蛋白濃度，放免法定期檢測(cè)血清抗dsDNA抗體的水平，ELISA法檢測(cè)血清補(bǔ)體C3及免疫球蛋白各亞型水平，血細(xì)胞分析儀及全自動(dòng)生化儀定期檢測(cè)給藥小鼠的全血細(xì)胞計(jì)數(shù)及肝腎功能。小鼠腎臟標(biāo)本進(jìn)行H&E染色，由腎臟病理專(zhuān)家盲法讀片，半定量評(píng)估腎小球累及及

5、腎小血管累及情況。免疫組化對(duì)小鼠腎臟IgG及CD20染色。
　　分離小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，流式檢測(cè)其中B細(xì)胞各亞群及漿細(xì)胞比例。脾臟淋巴細(xì)胞的BAFF、IL-6、IL-21、IL-17A表達(dá)水平采用實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)，血清BAFF水平采用ELISA法檢測(cè)。
　　小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行annexinⅤ/PI染色，流式鑒定其中凋亡細(xì)胞比例。采集健康人外周血總B細(xì)胞，體外F(ab')2 anti-IgM、IL-21、IL-4及CD40L聯(lián)

6、合刺激使其增殖，并進(jìn)行BrdU及7-AAD染色，流式檢測(cè)細(xì)胞周期，體外觀察艾拉莫得對(duì)正常人B細(xì)胞增殖及凋亡的影響。
　　結(jié)果：
　　艾拉莫德可明顯緩解MRL/lpr小鼠類(lèi)狼瘡樣疾病病情。小鼠經(jīng)艾拉莫德治療后蛋白尿發(fā)生時(shí)間和水平均顯著低于安慰劑組，腎臟病理顯示免疫性腎炎病變輕于安慰劑組，盲法評(píng)定的腎小球損傷及血管周?chē)装Y積分差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。艾拉莫德組小鼠抗ds-DNA抗體水平顯著低于安慰劑組，低補(bǔ)體血癥、高免疫球蛋白血也同

7、時(shí)得到明顯緩解。免疫組化顯示艾拉莫德組小鼠腎臟IgG免疫復(fù)合物沉積顯著少于安慰劑組，半定量吸光度計(jì)算顯示兩組具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。以上結(jié)果同時(shí)證實(shí)了艾拉莫德對(duì)小鼠體液免疫的抑制作用。
　　我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)艾拉莫德對(duì)MRL/lpr小鼠外周淋巴細(xì)胞具有多種調(diào)節(jié)作用。外周異常B220+T細(xì)胞及漿細(xì)胞比例經(jīng)艾拉莫德治療后下降，而外周總B細(xì)胞比例出現(xiàn)恢復(fù)，趨向于正常BALB/c小鼠水平;同時(shí)作為靶器官的腎組織中CD20+B細(xì)胞的浸潤(rùn)在艾拉莫德治

8、療后顯著減少。艾拉莫德組小鼠脾臟漿細(xì)胞數(shù)量顯著少于安慰劑組，與血清免疫球蛋白檢測(cè)結(jié)果相呼應(yīng)。小鼠脾臟內(nèi)異常升高的生發(fā)中心、邊緣區(qū)B細(xì)胞和異常降低的濾泡B細(xì)胞亞群比例經(jīng)過(guò)艾拉莫得治療后均得到部分糾正;艾拉莫德組脾臟內(nèi)異常增多的未成熟過(guò)度型B細(xì)胞比例也顯著低于安慰劑組;而環(huán)磷酰胺上述效應(yīng)并不明顯。MRL/lpr小鼠脾細(xì)胞及血清中促進(jìn)B細(xì)胞活化的多種細(xì)胞因子，包括BAFF、IL-6、IL-21、IL-17A水平在艾拉莫德給藥后出現(xiàn)明顯下降，與