PDTC對LPS誘導(dǎo)雌性MRL-lpr小鼠狼瘡樣癥狀的作用及其部分機制研究.pdf

1、研究背景:系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)是一種典型的、以產(chǎn)生多種自身抗體和形成免疫復(fù)合物為特征的全身性自身免疫性疾病,可累及多系統(tǒng)多器官。我國SLE患病率約為70/10萬,SLE好發(fā)于青年女性,尤其是20~40歲的育齡期婦女,發(fā)病率男女性別比為1:7~1:10。SLE發(fā)病是由遺傳因素和環(huán)境因素的交互作用引起的,女性多在育齡期發(fā)病,病人中約1/4~2/3有腎臟損害的臨床表現(xiàn),稱狼瘡腎炎(

2、1upus nephritis,LN)。
　　脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)為革蘭氏陰性細菌表面的主要成分,是一種強有力的免疫炎癥系統(tǒng)活化因子。通過激活NF-κB上調(diào)多種基因的表達水平,激活MAPK信號通路來誘導(dǎo)MCP-1的表達,進一步促進炎性細胞的浸潤。LPS是p38 MAPK和NF-κB信號通路的共同激活劑,激活p38可誘導(dǎo)NF-κB的某些靶基因表達上調(diào),而抑制p38可降低NF-κB的活性。同時體內(nèi)脂質(zhì)

3、過氧化物的累積可激活NF-κB進而加速細胞損傷、壞死和凋亡。
　　吡咯烷二硫代氨基甲酸(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)可抑制NF-κB的活性并清除體內(nèi)氧自由基,同時能通過抑制NF-κB降低體內(nèi)TNF-α、IL-1β、MCP-1等的水平。近年研究發(fā)現(xiàn),PDTC通過抑制NF-κB的激活來阻斷LPS誘導(dǎo)的炎性細胞因子的上升,進一步減輕腎臟和全身的炎癥反應(yīng)來改善腎臟功能。
　　本課題探討PDTC干

4、預(yù)LPS誘導(dǎo)的狼瘡傾向小鼠腎臟損害的作用及其可能的分子機制,為PDTC更好的用于SLE臨床治療奠定理論基礎(chǔ)。
　　目的:研究PDTC對LPS處理的雌性MRL/lpr小鼠腎臟中細胞增殖、凋亡、炎性細胞浸潤以及MCP-1、TGF-β1等分子表達的影響,初步探討PDTC拮抗LPS誘導(dǎo)的狼瘡傾向小鼠腎臟損傷的可能作用機制。
　　方法:選擇6周齡近交系MRL/lpr雌鼠28只,隨機分為LPS組(按每20g體重給予0.1ml LPS溶液

5、,給藥劑量約1.0mg/kg BW)、LPS+PDTC組[按每20g體重先給予0.1ml PDTC(60mg/kg BW),0.5h后給予0.1ml LPS溶液(1.0mg/kg BW)]、PDTC組[按每20g體重先給予0.1ml PDTC(60mg/kg BW)]和對照組(按每20g體重給予0.1ml生理鹽水溶液),每組7只。采用腹腔染毒方法,每周2次,共染毒14周。所有動物在染毒14周后處死,取左側(cè)腎臟置于10％福爾馬林固定、制作

6、石蠟切片,切4μm切片進行HE、PAS和Masson染色。在右腎切取約1mm3腎皮質(zhì)置于2.5%戊二醛固定,用于制備透射電鏡切片,于電鏡下觀察腎小球沉積物及基底膜的改變。用ELISA方法檢測血清抗ds-DNA、MCP-1和TGF-β1表達水平。用Western blot的方法檢測LPS和PDTC對MAPK信號通路相關(guān)蛋白pp38、p38、pERK、ERK、pJNK、JNK和凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase3、Caspase

7、9、NF-κB等表達的影響。用TUNEL染色檢測PDTC對LPS染毒小鼠腎臟細胞凋亡的影響。用免疫組化法檢測MCP-1和TGF-β1在MRL/lpr小鼠腎臟組織中的表達情況。
　　結(jié)果:動物實驗結(jié)果顯示,LPS染毒14周后,20周齡的雌性MRL/lpr小鼠的體重?zé)o統(tǒng)計學(xué)差異。與PDTC組小鼠相比,LPS組血清抗ds-DNA、MCP-1水平增高,TGF-β1水平下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與LPS組相比,PDTC干預(yù)組血

8、清抗 ds-DNA、MCP-1和 TGF-β1水平的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);與對照組相比,LPS組小鼠腎臟的NF-κB、pERK、pJNK、MCP-1、Bax、Bcl-2、Caspase3和Caspase9蛋白水平明顯上升;pp38和TGF-β1蛋白水平明顯下降;PDTC干預(yù)組小鼠腎臟NF-κB、pJNK、MCP-1和Caspase3蛋白水平低于LPS組(P<0.05);LPS組小鼠腎臟pp38、TGF-β1和Caspase

9、9蛋白表達水平下降(P<0.05);PDTC干預(yù)后上調(diào)pp38、TGF-β1和Bcl-2蛋白的表達(P<0.05)。
　　LPS組小鼠腎臟病理切片HE染色結(jié)果顯示,腎臟系膜細胞出現(xiàn)明顯增生和嚴重的炎性細胞浸潤,個別小鼠的腎臟出現(xiàn)明顯的系膜細胞壞死或腎臟壞死;PAS染色結(jié)果顯示:腎小球分葉明顯,系膜細胞增生明顯,基底膜彌漫性增厚,系膜區(qū)及基質(zhì)細胞增加;Masson染色結(jié)果顯示:腎小球和間質(zhì)均出現(xiàn)明顯的的纖維化和炎癥浸潤,系膜細胞及基

10、質(zhì)增多;電鏡下可見腎小球臟層上皮細胞(足細胞)的骨架改變、融合,足突消失,伴隨明顯的基底膜下電子致密物沉積。而PDTC可以明顯的改善LPS所致的腎臟損害;PDTC干預(yù)組的腎臟損害較PDTC組和對照組明顯。
　　結(jié)論:PDTC通過抑制NF-κB、pJNK和MCP-1表達來抑制炎性細胞浸潤等機制來改善LPS所致的腎臟損害。PDTC改善LPS誘導(dǎo)的MRL/lpr小鼠腎臟損害的作用機制與調(diào)節(jié)NF-κB、MAPK信號通路相關(guān)蛋白以及凋亡相關(guān)