輪紋病致病菌Botryosphaeria dothidea侵染對蘋果抗性反應、乙烯合成和相關基因表達的影響.pdf

1、蘋果輪紋病是我國蘋果產區(qū)的主要病害，屬于真菌性病害，主要危害枝干和果實，為果品生產造成重大威脅。因此研究蘋果果實與輪紋病菌之間的關系具有重要意義。我們通過研究和解析蘋果抗病及免疫機理，分析蘋果在受到病菌侵染后的各種生理活動和脅迫應答來挖掘蘋果抗病基因和了解蘋果抗病機制。蘋果抗病基因的挖掘是進行品種改良的基礎，對于培育抗病品種以及高效生產優(yōu)質蘋果具有重要的意義，同時該研究也對深入了解蘋果的抗病基因具有重要的意義。為蘋果優(yōu)新抗病種質資源的培

2、育提供科技支撐和依據(jù)，服務我國蘋果產業(yè)發(fā)展。
　　本實驗以‘富士’和‘金冠’兩種質地不同的蘋果果實為材料，通過對蘋果接種輪紋病菌后，測定果實乙烯釋放量、硬度、基因相對表達量來進行蘋果抗病性的系統(tǒng)研究，并對乙烯合成相關基因、細胞壁軟化基因和PR家族基因進行深入研究。結果表明相關基因被病菌大量誘導表達，兩個品種在抗蘋果輪紋病方面存在顯著差異，且蘋果在不同發(fā)育時期的抗病反應非常復雜。針對病程相關基因在蘋果抗病中的表達，我們從蘋果中篩選出

3、MdPR5和MdPR8，通過植物RNA的提取、PCR技術和基因克隆等方法，獲得蘋果中基因的cDNA序列，并對之進行了序列對比分析、基因表達和轉基因分析，通過分子生物學手段驗證不同種類蘋果中抗病基因的表達。主要研究結果如下：
　　1.植物體在逆境脅迫下的活性氧積累情況。以‘嘎拉’組培苗為試材，對葉片和植物接種輪紋病菌和flg22處理后，用DAB染色法檢測活性氧的產生情況。結果葉片在受到輪紋病菌和flg22處理后有明顯的黃色沉淀顆粒，

4、黃色顆粒越多說明活性氧產生的越多，植株在受到flg22處理后莖部發(fā)紅，說明葉片和植株都發(fā)生了逆境響應。
　　2.輪紋病菌接種富士和金冠兩個品種的蘋果果實，在幼果期、膨大期、成熟期三個發(fā)育時期的乙烯釋放速率、硬度變化、病斑大小差異明顯，且用1-MCP處理接菌的果實，抑制乙烯釋放的效果在不同品種的不同時期也不同，以金冠成熟期的變化最顯著，接菌后金冠果實的病斑和硬度都明顯小于富士的。對乙烯合成相關基因 MdERF2、MdACS4、MdC

5、TR1、MdACS5a、MdACS5b進行 qRT-PCR分析，結果表明在成熟期， MdACS5a、MdACS5b這兩個基因在輪紋病菌誘導下表達量明顯升高。研究1-MCP對基因表達量的影響，發(fā)現(xiàn)1-MCP對MdACS5a、MdACS5b表達量的升高有顯著抑制作用，1-MCP對MdACS4表達的抑制作用作用在金冠成熟期第六天較明顯。
　　3.接菌的富士和金冠兩種蘋果果實，在不同發(fā)育時期對細胞壁軟化基因AFS1、PG1和PRs中的Md

6、PR5、MdPR8、MdPR4進行qRT-PCR分析。發(fā)現(xiàn)接菌后幼果期和膨大期細胞壁軟化基因相對表達量有明顯升高。PRs相關基因的表達量在病菌侵染下也明顯增高，這表明PRs具有抗病性。
　　4.克隆MdPR5和MdPR8兩個病程相關基因，進行序列分析和表達分析，并進行原核誘導和SDS-PAGE分析。為蘋果抗病基因的挖掘和蘋果品種改良做出基礎性工作。并通過氨基酸序列對比分析發(fā)現(xiàn)MdPR5的氨基酸序列與蘋果、擬南芥、梨、榅桲的某些序列