表沒食子兒茶素沒食子酸酯對(duì)酒精性肝病小鼠鐵過載的作用和機(jī)制研究.pdf

1、研究背景及目的:
　　 酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)是因長(zhǎng)期、大量飲用各種含乙醇的飲料所致肝臟損害性病變,在組織病理學(xué)上主要表現(xiàn)為四種形式:酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、肝纖維化、肝硬化。ALD是全世界范圍內(nèi)倍受關(guān)注的公共衛(wèi)生問題。ALD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,涉及酒精及其代謝產(chǎn)物對(duì)肝臟的直接和間接損傷,同時(shí)還與營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)及遺傳易感性密切相關(guān)。大量證據(jù)表明,氧化應(yīng)激在酒精性肝病的發(fā)病中起著重要作用,氧化

2、應(yīng)激由產(chǎn)生過多的自由基(超氧化物,過氧化物,羥自由基)引起,可加速內(nèi)在抗氧化劑(谷胱甘肽,維生素A、C和E)的消耗或兩者同時(shí)發(fā)生。幾種內(nèi)源性自由基的來源,包括線粒體,黃嘌呤氧化酶,
　　 細(xì)胞色素P4502E1(CYP2E1),脂質(zhì)加氧酶和Fe2+,已經(jīng)在慢性酒精攝入的動(dòng)物肝臟中被證實(shí)。鐵通過催化超氧化物和過氧化氫轉(zhuǎn)變?yōu)楦鼜?qiáng)有力的氧化劑,如羥自由基或高鐵自由基,或超高鐵自由基的Fenton反應(yīng)而引起氧化應(yīng)激。這些強(qiáng)有力的自由基.

3、通過脂質(zhì)過氧化反應(yīng)及蛋白和DNA氧化引起組織損傷。大量證據(jù)表明,鐵在酒精性肝病中起著重要作用。在慢性消耗的酒精依賴個(gè)體中,平均肝鐵濃度大量增加,而且在酒精性肝硬化的患者中,肝鐵攝取率增加。
　　 對(duì)ALD的治療目前尚缺乏特效手段,所用研究藥物因副作用大而不能廣泛應(yīng)用于臨床,因此主要采用支持療法,予高蛋白、高維生素、低脂飲食,補(bǔ)充復(fù)合氨基酸、維生素類、微量元素鋅,維持電解質(zhì)及液體平衡等及對(duì)癥治療。鐵是生物體內(nèi)最重要的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)

4、促進(jìn)劑,鐵可啟動(dòng)或催化Haber-weiss反應(yīng),產(chǎn)生自由基破壞肝細(xì)胞的細(xì)胞器(主要是對(duì)溶酶體膜的破壞),最終造成肝細(xì)胞死亡。而肝細(xì)胞的死亡又會(huì)進(jìn)一步加重肝鐵過載,因?yàn)楦渭?xì)胞壞死后,肝細(xì)胞漿內(nèi)的鐵蛋白會(huì)被溶酶體消化,放出不溶性的含鐵血黃素,由此形成惡性循環(huán)。在這一過程中酒精和鐵對(duì)肝臟具有協(xié)同的損害作用。我們認(rèn)為打破這個(gè)惡性循環(huán)的關(guān)鍵是改善或消除肝鐵過載。
　　 綠茶作為傳統(tǒng)飲料的代表有利于人體健康。茶多酚、兒茶素是綠茶的主要成分

5、,它是一種多酚化合物,主要的兒茶素包括表兒茶素(Ec)、沒食子酸表兒茶素(ECG)、表沒食子酸兒茶素(EGC)和沒食子酸表沒食子酸兒茶素(EGCG),其中EGCG含量最高,占兒茶素的50％左右。EGCG作為茶多酚的主要單體及活性成分,具有許多重要的生物功能,如抗氧化、抗炎、鐵螯合及抗癌等作用的發(fā)揮主要依賴于EGCG。研究表明EGCG對(duì)鐵超載引起的機(jī)體損傷表現(xiàn)出良好的保護(hù)作用,這種作用可能主要是通過以下兩個(gè)方面來完成的:①抗氧化；②螯合金

6、屬鐵離子。大量實(shí)驗(yàn)證明,EGCG可以和鐵參與的氧化體系中的鐵離子發(fā)生作用,從而達(dá)到抑制氧化反應(yīng)的產(chǎn)生。
　　 然而,關(guān)于茶多酚對(duì)酒精性肝病鐵代謝異常的作用目前國(guó)內(nèi)外尚無報(bào)道。因此,本研究擬通過酒精灌胃建立ALD小鼠模型,以腹腔注射給予EGCG的方式,采取小鼠血清及肝組織標(biāo)本,比較不同劑量EGCG作用下的小鼠肝臟病理變化、血清ALT,AST水平、血清鐵,肝鐵含量及肝組織SOD活性、MDA含量與模型組小鼠之間的差異,觀察其對(duì)ALD小

7、鼠模型的保護(hù)和治療作用,采用Real-timePCR、Western blot等方法研究EGCG對(duì)ALD小鼠肝臟鐵代謝相關(guān)因子HepcidinmRNA及Tf、TfR1蛋白表達(dá)的作用,從分子水平探討EGCG治療ALD鐵過載的作用機(jī)制。
　　 材料與方法:
　　 6～8周齡雄性SPF級(jí)C57BL6小鼠70只,體重21±2g。購(gòu)回后飼養(yǎng)于恒溫,恒濕條件下自由攝取食水,飼養(yǎng)一周左右開始實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)分為正常組(12只)和模型組(58

8、只)。模型組小鼠每日予酒精灌胃,酒精劑量開始為4g/kg.d(溶液最大酒精含量為52％),計(jì)算方法為:酒精重量(g)=白酒體積(ml)×白酒酒精含量(v/v)×酒精密度(0.8/ml),5周內(nèi)酒精劑量逐漸增加到6g/kg.d,持續(xù)該劑量繼續(xù)喂養(yǎng)7周。正常對(duì)照組小鼠以等體積生理鹽水灌胃。8周末取正常對(duì)照組,模型組動(dòng)物各4只,剖殺,取血及肝臟組織,通過肝組織病理學(xué)及血清ALT、AST變化以確定模型建立是否成功。
　　 模型組小鼠于造

9、模第9周隨機(jī)分為5組,每組10只。即模型組；模型組+EGCG 10mg/kg組；模型組+EGCG 20mg/kg組；模型組+EGCG 30mg/kg組；模型組+去鐵胺200mg/kg組(陽性藥物組)。藥物均為腹腔注射給藥,正常對(duì)照組予等體積生理鹽水腹腔注射,每日一次,持續(xù)4周。實(shí)驗(yàn)至第12周末,小鼠禁食24h,剖殺,留取血及肝組織備檢。血標(biāo)本送檢珠江醫(yī)院檢驗(yàn)科檢測(cè)血清ALT、AST及血清鐵含量。將取材后的肝組織固定于4％多聚甲醛溶液,石

10、蠟包埋,5μm切片行HE染色,光鏡下觀察肝組織病理形態(tài)變化。另取肝組織制備10％組織勻漿,按試劑盒操作檢測(cè)肝組織蛋白含量、SOD活性及MDA含量。剩余肝組織置低溫冰箱-80℃冷凍保存,以Real-time PCR方法檢測(cè)Hepcidin mRNA表達(dá)水平,以Western blot印跡分析Tf和TfR1蛋白表達(dá)水平。
　　 結(jié)論:
　　 1.應(yīng)用逐漸增加酒精濃度和劑量灌胃的方法可以成功制作小鼠ALD模型,該模型肝臟病變可

11、反映臨床酒精性肝病的基本病變。
　　 2.ALD發(fā)病過程中存在鐵過載,鐵過載參與了ALD的發(fā)病過程,Hepcidin mRNA表達(dá)水平的下調(diào)及Tf、TfR1蛋白表達(dá)水平失衡可能是促進(jìn)病情進(jìn)展的重要因素之一。
　　 3.EGCG顯著降低了脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物MDA的含量,提高了抗氧化劑SOD的活性,促使氧化與抗氧化機(jī)制恢復(fù)平衡,同時(shí)也降低了肝臟轉(zhuǎn)氨酶水平,使肝臟組織學(xué)明顯改善。
　　 4.EGCG對(duì)小鼠ALD鐵過