基于cDNA芯片的玉米O2-o2 NIL胚乳差異表達(dá)基因的分析及O2啟動(dòng)子結(jié)合蛋白的分離.pdf

1、玉米是我國(guó)重要的糧食和飼料作物。由隱性o2基因控制的優(yōu)質(zhì)蛋白玉米（QPM）的籽粒中賴氨酸和色氨酸兩種單胃動(dòng)物必需氨基酸的含量較普通玉米高出一倍左右。O2基因是玉米重要的轉(zhuǎn)錄因子基因，在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平上參與調(diào)控玉米胚乳發(fā)育過(guò)程中多個(gè)基因的表達(dá)，其前導(dǎo)序列還可以調(diào)節(jié)自身基因的表達(dá)。闡明由o2基因引起胚乳醇溶蛋白合成的抑制、氨基酸代謝與淀粉合成的途徑改變、糖代謝水平下降、易感病感蟲(chóng)、雄蕊早熟等生理、生化和表型改變的分子機(jī)理對(duì)促進(jìn)玉米QPM

2、育種水平的提高具有重要的理論與實(shí)踐意義。 本研究選用玉米Hz85（O2/O2）/Hz85（o2/o2）和S7913（O2/O2）/S7913（o2/o2）兩套不同核背景下的近等基因系（NIL）為試材，提取授粉后3個(gè)不同天數(shù)（14、16、18DAP）的胚乳mRNA分別和本室已制備好的玉米胚乳全發(fā)育期的cDNA芯片雜交，在RNA水平上探討在顯性O(shè)2基因和隱性o2基因的調(diào)控下，玉米胚乳發(fā)育過(guò)程中的差異表達(dá)基因，對(duì)兩套NILs中均檢測(cè)到

3、相同差異的克隆進(jìn)行序列分析，討論O2胚乳表型形成的分子機(jī)制。鑒定和分離O2基因啟動(dòng)子的結(jié)合蛋白，探討調(diào)控O2基因表達(dá)的特異調(diào)控因子。獲得的主要結(jié)果如下： （1）在兩套近等基因系中均檢測(cè)到差異的克隆87個(gè)，對(duì)其進(jìn)行序列分析得到24個(gè)TUGs、12個(gè)未命名蛋白和5個(gè)新序列。這些TUGs分別參與了生長(zhǎng)發(fā)育、脅迫響應(yīng)、物質(zhì)運(yùn)輸、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、電子傳遞鏈、細(xì)胞防御、代謝等細(xì)胞過(guò)程，以及作為細(xì)胞組分和貯存蛋白。 （2）與編碼醇溶蛋白（z

4、ein）家族的蛋白序列同源的序列分別編碼15kD、19kD及其各個(gè)亞基、突變的19kD、19kD前體、22kD、y-zein等家族成員。其中當(dāng)o2發(fā)生突變后，除了γ-zein外的克隆都以相似的表達(dá)趨勢(shì)下調(diào)表達(dá)：在o2/o2材料授粉后16天的胚乳中，與O2/O2材料比較發(fā)現(xiàn)，zein的差異表達(dá)倍數(shù)最高，即表達(dá)量達(dá)到最低值，而在授粉后18天差異表達(dá)倍數(shù)有所下降，即表達(dá)量有所上升，但較O2/O2還是下調(diào)表達(dá)。 （3）γ-zein基因表

5、現(xiàn)為16DAP基因達(dá)到表達(dá)量最高峰，而到18DAP表達(dá)量有所下降，和O2的表達(dá)趨勢(shì)相似。同時(shí)在o2/o2 NILs中修飾基因上調(diào)表達(dá)，表明本室采用MAS結(jié)合表型選擇所獲得的兩個(gè)NILs有效地保留了兩個(gè)親本的修飾基因，并在o2/o2胚乳中發(fā)揮了對(duì)胚乳的修飾作用。 （4）在o2/o2材料中檢測(cè)到透性酶基因、鐵離子接受蛋白基因和Sec61的a2型基因等與物質(zhì)運(yùn)輸相關(guān)的克隆和ATPase，銅結(jié)合蛋白CUTA、過(guò)氧化物酶、Mn-過(guò)氧化物歧

6、化酶等與細(xì)胞防御相關(guān)的基因均在o2/o2材料都較O2/O2材料下調(diào)表達(dá)。在以上結(jié)果的基礎(chǔ)上，討論了o2籽粒粉質(zhì)不透明胚乳的形成可能是由于細(xì)胞膨大和物質(zhì)運(yùn)輸能力、細(xì)胞防御能力下降造成的。 （5）選用玉米自交系HZ010519，提取胚乳核蛋白并從總DNA中特異擴(kuò)增出O2基因啟動(dòng)子序列，采用EMSA技術(shù)，獲得了O2啟動(dòng)子序列與蛋白質(zhì)結(jié)合產(chǎn)生的阻滯條帶。采用Dynabead磁珠分離技術(shù)得到與O2啟動(dòng)子序列結(jié)合的3個(gè)蛋白質(zhì)，質(zhì)譜分析結(jié)果顯