麋鹿皮膚成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)與細(xì)胞周期同步化研究.pdf

1、本文以麋鹿的耳尖皮膚組織為材料進(jìn)行皮膚成纖維細(xì)胞的分離與培養(yǎng)，對皮膚成纖維細(xì)胞進(jìn)行傳代、冷凍保存、解凍復(fù)蘇和部分生物學(xué)特性的鑒定；用不同匯合程度、血清饑餓不同時間以及含羞草酸不同劑量和時間對糜鹿皮膚成纖維細(xì)胞進(jìn)行同步化處理后，用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期同步化的效果，豐富麋鹿研究的內(nèi)容。為組織工程研究提供借鑒資料，為麋鹿的基礎(chǔ)研究和保護(hù)瀕危珍稀動物資源提供基礎(chǔ)資料。研究結(jié)果如下： 1 麋鹿耳皮膚成纖維細(xì)胞的分離與體外培養(yǎng) 本試驗(yàn)采用組織塊

2、法進(jìn)行原代培養(yǎng)，獲得麋鹿成纖維細(xì)胞，并經(jīng)過反復(fù)傳代得以純化。對細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)冷凍保存，得到麋鹿皮膚成纖維細(xì)胞系．F4代生長曲線中，第5 d群體倍增值為5.50，群體倍增時間為39.03 h，第6 d細(xì)胞生長減慢；由分裂曲線看出，分裂指數(shù)最高時期是在培養(yǎng)的第5 d，第6 d急劇下降,細(xì)胞生長曲線與分裂指數(shù)表明，麋鹿皮膚成纖維細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下存在早期生長延緩和晚期生長抑制，屬于正常的體細(xì)胞。麋鹿染色體教目為2n=68，核型式為2(M)＋6

3、4(A)，XY(A，M)。血清濃度對細(xì)胞的生長有影響，10％和15％NCS組有明顯的對數(shù)生長期，但在對數(shù)生長期末凋亡和死亡的細(xì)胞數(shù)較多，20％NCS組沒有明顯的對數(shù)生長期，并且細(xì)胞數(shù)目少于10％和15％NCS組，因此細(xì)胞培養(yǎng)過程中采用10％NCS，每3 d換一次液，在發(fā)生密度抑制和接觸抑制前就進(jìn)行傳代，避免營養(yǎng)枯竭和代謝物積累。細(xì)胞冷凍時采用10％DMSO作冷凍保護(hù)劑，冷凍時先在4℃放置30 min，移入-20℃放置1.5 h，再在液氮

4、面上方懸吊7～8 h后投入液氮，復(fù)蘇后可獲得87.78％的貼壁率。 2 麋鹿皮膚成纖維細(xì)胞的細(xì)胞周期同步化研究：為了了解麋鹿細(xì)胞周期調(diào)控的特點(diǎn)，本試驗(yàn)對麋鹿皮膚成纖維細(xì)胞進(jìn)行不同匯合程度、血清饑餓不同時間以及含羞草酸(mimosine)不同劑量和時間的處理，利用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期。結(jié)果表明，100％匯合1d的細(xì)胞GO/Gl期比例可達(dá)91.95％，但是匯合2d后繼續(xù)培養(yǎng)會導(dǎo)致DNA片段化和細(xì)胞的異常聚集。血清饑餓能夠迅速地改變麋鹿皮膚

5、成纖維細(xì)胞的細(xì)胞周期狀態(tài)，使GO/G1期細(xì)胞比例升高，G2/M期細(xì)胞比例降低，血清饑餓處理24h后有89.42％的細(xì)胞處于GO/GL期,當(dāng)處理時間超過144h后細(xì)胞凋亡和異常聚集的比例會增加。適宜劑量的含羞草酸能夠使麋鹿成纖維細(xì)胞達(dá)到同步化的目的，但效果低于接觸抑制和血清饑餓,并且也會對細(xì)胞造成損傷。 本研究的創(chuàng)新之處在于豐富了麋鹿研究的基礎(chǔ)資料。麋鹿有“活化石”之稱，但目前對麋鹿的基礎(chǔ)研究在許多方面仍是空白，本試驗(yàn)建立麇鹿皮膚