鹽酸苯環(huán)壬酯及其旋光異構(gòu)體對(duì)NMDA神經(jīng)毒性的保護(hù)效應(yīng)及其作用機(jī)制.pdf

1、鹽酸苯環(huán)壬酯(phencynonate hydrochloride，PCH，)，商品名“飛賽樂(lè)”，是我所合成的中樞性抗膽堿能藥物，用于暈動(dòng)病的治療，具有療效強(qiáng)，中樞不良反應(yīng)少的特點(diǎn)。已有研究提示苯環(huán)壬酯兼具有抗膽堿能和抗NMDA作用。由于其分子結(jié)構(gòu)中存在一個(gè)手性碳原子，苯環(huán)壬酯具有R(-)和S(+)兩種不同構(gòu)象。不同旋光異構(gòu)體對(duì)抗NMDA的效應(yīng)是否存在差異，其機(jī)制如何，目前尚不清楚。 谷氨酸是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的興奮性

2、神經(jīng)遞質(zhì)，參與中樞興奮性突觸傳遞，與突觸可塑性和長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)等重要生理過(guò)程有關(guān)。其受體可分為促離子型和促代謝型兩種。N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受體屬于離子型谷氨酸受體。包括NMDA受體在內(nèi)的谷氨酸受體的正?；钚詾榫S持生理功能所必需，然而其持續(xù)過(guò)度的活化卻會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元的死亡，這是急性腦損傷諸如癲癇、中風(fēng)之后神經(jīng)細(xì)胞死亡的重要原因，也是許多慢性神經(jīng)退行性病變，如帕金森病(Parkinson’s

3、 disease，PD)、亨廷頓舞蹈病(Huntington’s disease，HD)、阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)等的發(fā)病及病程發(fā)展中的重要因素。不同的藥物可通過(guò)不同的途徑發(fā)揮抗興旮陛毒性的作用。然而，苯環(huán)壬酯及其異構(gòu)體通過(guò)何種機(jī)制達(dá)到神經(jīng)保護(hù)作用尚無(wú)研究報(bào)道。本研究通過(guò)比較PCH消旋體、R(-)-PCH和S(+)-PCH的抗NMDA神經(jīng)毒性效應(yīng)及其對(duì)大鼠心血管和呼吸系統(tǒng)的影響，旨在找到保護(hù)效應(yīng)強(qiáng)，不

4、良反應(yīng)少的優(yōu)性異構(gòu)體，為其進(jìn)一步的合理開(kāi)發(fā)利用提供研究參考，進(jìn)而為NMDA：相關(guān)疾病的治療提供新的藥物選擇；同時(shí)對(duì)其可能保護(hù)機(jī)制進(jìn)行探索，為今后的研究奠定基礎(chǔ)。 1 鹽酸苯環(huán)壬酯及其異構(gòu)體抗NMDA神經(jīng)毒性保護(hù)作用的比較 NMDA致死模型是檢驗(yàn)藥物是否具有拮抗NMDA活性的唯一藥理終結(jié)點(diǎn)，具有可靠性強(qiáng)，易重復(fù)的特點(diǎn)，該致死效應(yīng)只能被苯環(huán)利定樣藥物和特異性NMDA受體拮抗劑阻斷。PC12細(xì)胞為大鼠腎上腺嗜鎘細(xì)胞瘤細(xì)胞，在神

5、經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor)作用下細(xì)胞表達(dá)功能性的NMDA受體，廣泛用于細(xì)胞膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與細(xì)胞內(nèi)信使、興奮性神經(jīng)毒性和神經(jīng)保護(hù)機(jī)制的研究。 本研究建立NMDA的小鼠致死模型租PC12細(xì)胞損傷模型，通過(guò)并比較PCH不同旋光異構(gòu)體的神經(jīng)保護(hù)作用，旨在找到保護(hù)效應(yīng)更強(qiáng)的優(yōu)性異構(gòu)體，進(jìn)而為NMDA相關(guān)疾病的治療提供新的藥物選擇。結(jié)果表明，PCH不同旋光異構(gòu)體在體內(nèi)外均可對(duì)抗NMDA的損傷效應(yīng)。R(-)-PCH可以對(duì)

6、抗NDMA的致死效應(yīng)，顯著提高小鼠存活率，保護(hù)效應(yīng)優(yōu)于S(+)-PCH；PCH消旋體的最佳保護(hù)效應(yīng)與R(-)-PCH相當(dāng)，但所需劑量高于R(-)-PCH。細(xì)胞存活率(MTT法)和LDH漏出檢測(cè)結(jié)果表明，R(-)-PCH可以顯著提高NMDA損傷作用后的細(xì)胞存活率，并有效抑制NMDA所致的細(xì)胞LDH漏出增加；S(+)-PCH對(duì)NMDA損傷后的細(xì)胞存活率無(wú)明顯影響，但可以有效抑制LDH的漏出；PCH消旋體的保護(hù)作用介于二者之間。R(-)-PC

7、H和PCH消旋體可明顯改善NMDA引起的細(xì)胞形態(tài)學(xué)病理改變，S(+)-PCH對(duì)形態(tài)學(xué)改變的保護(hù)作用相對(duì)較弱。 2 鹽酸苯環(huán)壬酯及其異構(gòu)體抗NMDA神經(jīng)毒性的保護(hù)作用機(jī)制 NMDA受體的過(guò)度激活導(dǎo)致胞內(nèi)Ca<'2+>超載并超出線(xiàn)粒體的承受能力，干擾了電子傳遞從而導(dǎo)致活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)的生成。研究發(fā)現(xiàn)線(xiàn)粒體去極化的程度和Ca<'2+>穩(wěn)態(tài)失衡的程度呈現(xiàn)高度的一致性，但上述相

8、關(guān)性并不能被ROS的過(guò)量生成所解釋。為檢驗(yàn)PCH的保護(hù)作用機(jī)制是否與阻斷NMDA所致的上述病理性改變有關(guān)，本研究對(duì)上述指標(biāo)及其相互關(guān)系進(jìn)行了研究。藥物處理后的PC12細(xì)胞分別用相應(yīng)的熒光探針(Hoechst 33258、Fluo-3/AM、Rhodamine 123、DCFH-DA)標(biāo)記，采用激光共聚焦系統(tǒng)軟件Laserpix5.0程序采集處理細(xì)胞相差圖像及熒光圖像，并測(cè)定細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度值。結(jié)果表明，PCH不同旋光異構(gòu)體對(duì)NMDA所致

9、的PC12細(xì)胞凋亡、胞內(nèi)Ca<'2+>穩(wěn)態(tài)失衡、線(xiàn)粒體膜電位降低、ROS過(guò)量生成均有對(duì)抗作用。R(-)-PCH在抑制NMDA所致的上述細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)變化方面均顯示出比S(+)-PCH更強(qiáng)的保護(hù)效應(yīng)，與NMDA受體非特異性拮抗劑MK-801作用相當(dāng)；PCH消旋體作用介于兩種旋光異構(gòu)體之間，也顯示出顯著性保護(hù)作用；而S(+)-PCH只對(duì)凋亡和ROS生成有顯著性抑制作用。結(jié)合第一部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果，R(-)-PCH可以顯著提高小鼠和PC12細(xì)胞存活率，

10、而S(+)-PCH卻無(wú)明顯效應(yīng)，不難得出：對(duì)Ca<'2+>超載和線(xiàn)粒體去極化的阻滯在PCH及其異構(gòu)體的保護(hù)作用機(jī)制中起重要作用，對(duì)ROS生成的阻滯在保護(hù)機(jī)制中并不發(fā)揮主要作用。 3 鹽酸苯環(huán)壬酯及其異構(gòu)體對(duì)大鼠心血管和呼吸系統(tǒng)的影響 本研究對(duì)PCH不同旋光異構(gòu)體對(duì)大鼠心血管和呼吸系統(tǒng)的影響進(jìn)行比較，旨在找到不良反應(yīng)少的優(yōu)性異構(gòu)體，從而為NMDA相關(guān)疾病的治療提供新的藥物選擇。Wistar大鼠隨機(jī)分為10組，每組10只，雌

11、雄各半，分別設(shè)為R(-)PCH、S(+)PCH和PCH消旋體3.5、7、14mg/kg 3個(gè)劑量組和生理鹽水對(duì)照1組。動(dòng)物分離左側(cè)股總動(dòng)脈作動(dòng)脈插管同時(shí)氣管插管，單次灌胃給藥后記錄血壓、心電圖和心率，描記呼吸波形、記錄呼吸頻率及潮氣量。以每個(gè)時(shí)間點(diǎn)60s內(nèi)平均值作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。再以每組動(dòng)物各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上平均值的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差與對(duì)照組進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，R(-)PCH、S(+)PCH和PCH消旋體對(duì)大鼠呼吸頻率、潮氣量和心率無(wú)明顯影響，不同旋

12、光異構(gòu)體對(duì)血壓均有降低趨勢(shì)，但劑量效應(yīng)關(guān)系不明顯。 綜上，PCH不同旋光異構(gòu)體在體內(nèi)外均能對(duì)抗NMDA的神經(jīng)毒性作用。R(-)-PCH在體內(nèi)體外的保護(hù)效應(yīng)均優(yōu)于S(+)-PCH，保護(hù)作用與MK-801相當(dāng)，是優(yōu)性異構(gòu)體，PCH消旋體的作用介于兩個(gè)旋光異構(gòu)體之間；抑制胞內(nèi)Ca<'2+>超載和線(xiàn)粒體的去極化在PCH及其異構(gòu)體的保護(hù)作用機(jī)制中起重要作用；在本實(shí)驗(yàn)條件下R(-)PCH、S(+)PCH和PCH消旋體對(duì)大鼠呼吸頻率、潮氣量和