人參總甙對雙酚A細胞毒性效應(yīng)的保護作用及其機制研究.pdf

1、目的：
　　 隨著環(huán)境污染加劇，如大量的環(huán)境雌激素的使用，人類生殖功能呈現(xiàn)下降趨勢。人參總甙具有改善生殖功能的效應(yīng)，但對其機制研究報告較少。支持細胞又稱為“nursing”cell，對雄性生殖具有重要意義，本研究擬觀察人參總甙對雙酚A引起15P-1 sertoli cells毒性效應(yīng)的保護作用，并探究其機制。
　　 方法：
　　 小鼠睪丸支持細胞（15p-1 sertoli cell）培養(yǎng)于含10％胎牛血清的DM

2、EM（高糖）培養(yǎng)基、5％CO2、32℃恒溫培養(yǎng)箱中。在培養(yǎng)基中加入不同濃度的BPA和人參總甙，用MTT法確定最佳作用濃度及作用時間。然后將細胞分為：（1）正常對照組；（2）雙酚A誘導(dǎo)組，培養(yǎng)基中加入終濃度為100μM的雙酚A；（3）人參總甙預(yù)處理+雙酚A組，細胞經(jīng)75μg/ml的人參總甙預(yù)處理24小時后，加入終濃度100μM的雙酚A；（4）人參總甙處理組，加入75μg/ml的人參總甙。采用倒置顯微鏡及電子顯微鏡觀察細胞形態(tài)，免疫熒光染色

3、法觀察細胞骨架蛋白Vimentin的表達，MTT法及Annexin-V/PI雙染流式細胞儀檢測細胞增殖率及凋亡率。用Q-PCR法和Western blotting法檢測不同時間點各組細胞ClusterinmRNA和蛋白表達情況。采用Western blotting法檢測各組細胞凋亡相關(guān)蛋白bcl-2、bax及磷酸化的ERK1/2、JNK、p38表達水平。用FRAP等法分別檢測各組細胞總抗氧化能力（Total Antioxidant Ca

4、pacity，T-AOC）及丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、還原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）、總超氧化物歧化酶（Total SuperoxideDismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione Peroxidase，GPx）、谷胱甘肽還原酶（Glmathione Reductase，GR）的水平。以Clusterin為靶向基因，構(gòu)建3個干擾質(zhì)粒。用脂質(zhì)體法瞬時轉(zhuǎn)染細胞，Q-P

5、CR及Western blotting法鑒定質(zhì)粒的干擾效率。雙酚A和人參總甙分別處理Clusterin干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的支持細胞，用Western blotting法檢測Clusterin蛋白表達水平，用MTT法及流式細胞技術(shù)檢測各組細胞增殖率和凋亡率。
　　 結(jié)果：
　　 1、100μM的雙酚A能有效地誘導(dǎo)細胞凋亡，75μg/ml的人參總甙處理24h對15p-1 sertoli細胞無明顯生長促進作用（P>0.05）。

6、>　　 2、100μM的雙酚A處理15p-1 sertoli細胞24小時后，細胞出現(xiàn)明顯的凋亡改變，光鏡下可見支持細胞由短梭形變狹長、甚至扭曲，進而開始脫壁、變圓；電鏡下可見典型的凋亡小體等；流式細胞技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)凋亡率明顯地上升；免疫熒光染色法分析發(fā)現(xiàn)骨架蛋白Vimentin表達發(fā)生改變；Clusterine mRNA和蛋白表達在24小時內(nèi)呈現(xiàn)先增高后降低的表達趨勢；凋亡相關(guān)蛋白bcl-2/bax的值顯著下降；雙酚A作用于15p-1

7、sertoli細胞4小時后，磷酸化的。ERK1/2開始出現(xiàn)，持續(xù)表達至24小時；細胞內(nèi)MDA水平升高；GSH和GSSG、總SOD、總抗氧化能力、GPx、GR的水平降低。
　　 3、用75μg/ml的人參總甙對15p-1 sertoli細胞進行預(yù)處理后再加入的雙酚A，光鏡及電鏡下均發(fā)現(xiàn)細胞形態(tài)接近對照組；凋亡率明顯下降；骨架蛋白Vimentin表達正常；Clustering mRNA的表達雖然也呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，但幅度明顯較

8、的雙酚A組小，且表達水平始終高于正常組，Clusterin蛋白的雙向改變受抑制，呈現(xiàn)穩(wěn)定表達；bcl-2/bax的值接近正常；磷酸化的ERK1/2表達明顯受抑制；MDA水平顯著下降；GSH、總SOD、總抗氧化能力、GPx、GR的水平升高。
　　 4、轉(zhuǎn)染攜帶干擾片段的質(zhì)粒可有效下調(diào)15p-1 sertoli細胞Clusterin基因及蛋白的表達，影響細胞正常增殖，并使得雙酚A誘導(dǎo)的細胞凋亡率升高。人參總甙可上調(diào)轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒的支持

9、細胞Clusterin蛋白表達，并提高細胞增殖率。
　　 結(jié)論：
　　 1、雙酚A可通過MAPK信號通路、擾亂細胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)及擾亂Clusterin的穩(wěn)定表達，對15p-1 sertoli細胞產(chǎn)生細胞毒性效應(yīng)。
　　 2、人參總甙可抑制雙酚A的細胞毒性作用。其機制可能是通過降低磷酸化的ERK1/2水平，增強細胞抗氧化能力，穩(wěn)定特異蛋白Clusterin的表達來實現(xiàn)的。人參總甙在保護生殖系統(tǒng)免遭環(huán)境雌激素雙酚A破