神經(jīng)甾體對(duì)Aβ所致神經(jīng)損害的保護(hù)作用及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、阿爾采末病(Alzheimer's disease,AD,曾譯名阿爾茨海默病,又稱早老性癡呆)是一種以進(jìn)行性記憶和認(rèn)知功能損傷為特征的退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病,是老年期癡呆中最為常見類型。1906年,德國(guó)醫(yī)生Alosis Alzheimer首次對(duì)該病患者的癥狀和病理改變進(jìn)行描述,AD因此而得名。AD常發(fā)生于65歲以上的老年人群。隨著年齡增長(zhǎng),AD發(fā)病率迅速增加,在65～74歲人群中AD發(fā)病率約為4％左右,而在85歲以上的老年人中,該比例高達(dá)5

2、0％左右。AD的確切致病機(jī)理至今仍無定論,也缺乏對(duì)其有效的根治藥物。目前的治療手段僅能有限的緩解AD的部分癥狀。截至2008年,全球范圍內(nèi)進(jìn)行了500余項(xiàng)針對(duì)AD治療的臨床試驗(yàn),均未能取得滿意的療效。在歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家,每年用于AD患者的費(fèi)用超過1000億美元。給患者、家庭和社會(huì)都帶來沉重的負(fù)擔(dān)。因此,開發(fā)對(duì)AD有效的干預(yù)措施和治療手段已成為AD研究的熱點(diǎn),也是一個(gè)倍受關(guān)注的社會(huì)問題。
　　 AD主要病理特征為腦內(nèi)細(xì)胞外老年斑(s

3、enile plaques,SP)沉積、細(xì)胞外神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles,NFT)及大腦皮質(zhì)等腦區(qū)內(nèi)神經(jīng)元和突觸缺失變性。Β-淀粉樣蛋白(β-amyloid,Aβ)是AD主要病理改變--SP的主要成分,在體內(nèi)由淀粉樣前體蛋白在β-裂解酶作用下生成。目前的研究認(rèn)為,腦內(nèi)神經(jīng)元胞外Aβ沉積可能是AD致病的核心機(jī)制,也是治療AD的潛在靶點(diǎn)之一。大量研究證實(shí),Aβ具有較強(qiáng)的聚集能力(老化),老化的Aβ纖維具有極

4、強(qiáng)的神經(jīng)毒性。生理狀態(tài)下,Aβ生成和清除保持著平衡的穩(wěn)態(tài)?；蛲蛔兒铜h(huán)境等因素破壞上述平衡狀態(tài),導(dǎo)致Aβ積聚而引發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng),造成神經(jīng)元功能失調(diào)并死亡,通過氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡及促發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)等途徑引起或促進(jìn)AD發(fā)展。
　　 大量研究表明,AD患者認(rèn)知功能損害與腦內(nèi)神經(jīng)元,尤其是大腦皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元大量丟失密切相關(guān),而神經(jīng)元丟失可能主要是Aβ毒性作用誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡所致。凋亡是細(xì)胞在發(fā)育過程中或在某些因素作用下,通過細(xì)胞內(nèi)基因及其產(chǎn)

5、物的調(diào)控而發(fā)生的一種程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death,PCD),是細(xì)胞在特定環(huán)境下的主動(dòng)自殺過程。目前研究認(rèn)為,細(xì)胞凋亡活動(dòng)過盛可能是導(dǎo)致AD進(jìn)行性神經(jīng)病變的重要原因之一。凋亡發(fā)生涉及復(fù)雜的分子生物學(xué)機(jī)制,其中半胱氨酸-天冬氨酸特異蛋白酶網(wǎng)絡(luò)-caspase家族在凋亡過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Caspase是一類半胱氨酸蛋白酶,正常情況下caspase均以非活性的酶原形式存在于細(xì)胞中,凋亡刺激因子可誘導(dǎo)它們逐級(jí)水解

6、活化,啟動(dòng)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng),特異性水解一系列蛋白質(zhì)底物,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。目前已發(fā)現(xiàn)caspase家族蛋白成員至少有14個(gè),其中caspase-3是各種細(xì)胞凋亡通路的最終執(zhí)行者,被稱作細(xì)胞凋亡的“終結(jié)者”。
　　 根據(jù)凋亡啟動(dòng)與傳導(dǎo)通路可以把細(xì)胞凋亡途徑大致分為2類,即死亡信號(hào)-受體途徑和線粒體途徑。大量體外實(shí)驗(yàn)表明Aβ可能主要通過線粒體途徑引起神經(jīng)元的凋亡。Aβ刺激線粒體膜并導(dǎo)致其通透性增加,位于線粒體膜內(nèi)的細(xì)胞色素C(cy

7、tochrome c,Cyt-c)釋放到細(xì)胞質(zhì)中,作為凋亡誘導(dǎo)因子,Cyt-c能在ATP/dATP存在的條件下與凋亡蛋白酶激活因子(apoptotic protease activating factor1,Apaf-1)結(jié)合,誘導(dǎo)Apaf-1自身多聚化形成8亞基單位的Apaf-1多聚體,通過N端粘附caspase-9前體形成凋亡體,然后召集并激活caspase-3,進(jìn)而引發(fā)caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng),導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。
　　 近年來

8、,大量研究表明神經(jīng)甾體對(duì)治療包括AD在內(nèi)的神經(jīng)退行性疾變具有重要的意義。內(nèi)源性神經(jīng)甾體是由腦組織(神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞)在各種甾體生成酶的作用下經(jīng)膽固醇或自外周循環(huán)進(jìn)入神經(jīng)系統(tǒng)的各種前體合成的一類甾體物質(zhì)的總稱。它們具有廣泛的生物學(xué)活性,被視為第四代神經(jīng)遞質(zhì),是近20年來最為引人注目的一類神經(jīng)保護(hù)劑。其中主要的神經(jīng)甾體包括孕烯醇酮(pregnenolone,PREG)及其硫酸酯(pregnenolonesulfate,PREGS)、脫氫表雄

9、酮(dehydroepiandrosterone,DHEA)及其硫酸酯(dehydroepiandrosterone sulfate,DHEAS)、孕酮(progesterone,PROG)及別孕烯醇酮(allopregnanolone,AP)等。
　　 在對(duì)AD患者進(jìn)行尸檢時(shí)發(fā)現(xiàn)其腦內(nèi)神經(jīng)甾體水平下降的現(xiàn)象,同時(shí)AD患者腦內(nèi)的關(guān)鍵致病蛋白(如Aβ等)增多,由此推測(cè)神經(jīng)甾體可能參與了AD的發(fā)病過程,提示它們對(duì)AD可能具有保護(hù)作用

10、。另有體外研究發(fā)現(xiàn),PREG和DHEA能夠通過抗自由基氧化、抑制糖皮質(zhì)激素受體(glucocoticoid receptor,GR)活性等機(jī)制對(duì)抗Aβ引起的神經(jīng)毒性作用,減少神經(jīng)細(xì)胞死亡。有人提出假說,高濃度Aβ可能通過抑制具有神經(jīng)保護(hù)作用的內(nèi)源性神經(jīng)甾體合成而引起神經(jīng)毒性。
　　 雖然部分神經(jīng)甾體(如PREG和DHEA)已顯示出對(duì)抗Aβ神經(jīng)毒性的作用,但目前對(duì)內(nèi)源性神經(jīng)甾體參與調(diào)節(jié)AD病變時(shí)的細(xì)胞機(jī)制還知之甚少,尤其是對(duì)Aβ?lián)p

11、傷神經(jīng)細(xì)胞時(shí)腦內(nèi)神經(jīng)甾體合成與代謝的變化情況缺乏足夠了解。在神經(jīng)系統(tǒng)中,PREG和DHEA均處于神經(jīng)甾體合成代謝的上游,是合成其它神經(jīng)甾體的前體物質(zhì),它們所表現(xiàn)出的神經(jīng)保護(hù)作用可能是其本身和其下游神經(jīng)甾體作用的共同結(jié)果。此外,神經(jīng)甾體的神經(jīng)保護(hù)作用還可能涉及更多的機(jī)制,如調(diào)節(jié)各種細(xì)胞膜受體的活性、影響細(xì)胞質(zhì)內(nèi)各種細(xì)胞器的功能及調(diào)節(jié)各種細(xì)胞內(nèi)受體和因子。
　　 目的:以原代培養(yǎng)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元方法為基礎(chǔ),采用Aβ活性片斷Aβ25-

12、35體外誘導(dǎo)損傷神經(jīng)元建立AD細(xì)胞模型;采用固相萃取結(jié)合HPLC-MS方法對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的AD模型神經(jīng)元損傷時(shí)主要神經(jīng)甾體PREG、DHEA、PROG及AP合成代謝水平的變化進(jìn)行研究;以Aβ25-35損傷大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元時(shí)神經(jīng)甾體合成與代謝通路中發(fā)生顯著改變的PROG和AP為干預(yù)物質(zhì),探討它們對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的神經(jīng)元毒性作用的影響,并進(jìn)一步探討PROG保護(hù)神經(jīng)元對(duì)抗Aβ的神經(jīng)毒性的作用和機(jī)制,旨在為AD的預(yù)防和治療提供新思路。<

13、br>　　 方法:
　　 1大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元原代培養(yǎng)與形態(tài)觀察
　　 2細(xì)胞樣品收集與定量
　　 3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率
　　 4細(xì)胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶活性的測(cè)定
　　 5固相萃取結(jié)合LC-MS法測(cè)定培養(yǎng)液中主要神經(jīng)甾體的水平
　　 6 Hoechest33342核染色法檢測(cè)神經(jīng)元凋亡
　　 取分組加藥處理后的神經(jīng)元細(xì)胞,棄去培養(yǎng)基,用冷生理鹽水沖洗,加入4％多聚甲醛固定,

14、棄固定液,用冷生理鹽水沖洗3遍,加入Hoechest33342(5 mg·L-1)染色5 min,再用生理鹽水漂洗2遍,熒光顯微鏡下,隨機(jī)選取6個(gè)視野/孔(每個(gè)視野100個(gè)細(xì)胞)進(jìn)行形態(tài)觀察和計(jì)數(shù),計(jì)算凋亡率。
　　 7 Western-blot檢測(cè)胞漿中Cyt-c、caspase-9及caspase-3蛋白表達(dá)
　　 8數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析
　　 結(jié)論:
　　 1.本研究考察了Aβ活性片斷Aβ25-35對(duì)

15、原代培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的損傷作用,建立了Aβ25-35體外誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷的AD細(xì)胞模型。采用1μmol·L-1Aβ25-35處理24 h可致神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變;經(jīng)MTT法檢測(cè),神經(jīng)元存活率降低50％左右。
　　 2.建立了靈敏、簡(jiǎn)便、可靠的固相萃取結(jié)合HPLC-MS法,可同時(shí)分析測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中4種主要神經(jīng)甾體PREG、DHEA、PROG及AP的濃度,適用于體外培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞神經(jīng)甾體合成代謝變化的相關(guān)研究。
　　

16、 3.Aβ25-35致神經(jīng)元損傷時(shí)PREG-PROG-AP合成代謝通路發(fā)生明顯改變,PROG生成顯著減少,AP生成顯著增多,提示選擇性地應(yīng)用上述神經(jīng)甾體處理或?qū)ο嚓P(guān)酶活性進(jìn)行調(diào)節(jié),恢復(fù)由Aβ引起的神經(jīng)元內(nèi)各種神經(jīng)甾體水平的失衡,可能對(duì)Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性具有積極的作用。
　　 4.PROG能濃度依賴地抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性作用,提高細(xì)胞存活率;而其代謝物AP能濃度依賴地加重Aβ25-35引起的神經(jīng)元存活度降低,不能產(chǎn)生

17、對(duì)抗Aβ25-35神經(jīng)毒性的保護(hù)性作用。
　　 5.Aβ25-35可通過誘導(dǎo)激活神經(jīng)元凋亡途徑導(dǎo)致神經(jīng)元存活率降低。PROG能濃度依賴地抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡,抑制胞漿caspase-3表達(dá)水平上調(diào),對(duì)Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。
　　 6.PROG能通過抑制線粒體凋亡途徑的激活,濃度依賴地抵制Aβ25-35誘導(dǎo)產(chǎn)生的Cyt-c表達(dá)水平上調(diào)及caspase-9表達(dá)水平下凋,對(duì)抗Aβ誘導(dǎo)的損傷作用,保