胰腺炎相關(guān)蛋白基因(pap)對(duì)大鼠肝再生的作用研究.pdf

1、胰腺炎相關(guān)蛋白(PAP)，是從胰腺炎患者的胰液中發(fā)現(xiàn)的一種炎癥蛋白，有促進(jìn)有絲分裂、抗細(xì)胞凋亡、抗炎癥和促進(jìn)細(xì)胞與胞外基質(zhì)粘附等作用。為揭示其在肝再生中的作用，本文根據(jù)大鼠pap基因的mRNA序列，采用分子克隆的方法克隆出Pap基因。在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)干涉片段并構(gòu)建出Pap基因的兩個(gè)干涉載體pGenesil-1.0-pap(289)和pGenesil-1.0-pap(485)，三個(gè)檢驗(yàn)載體pGenesil-1.0-pap(289)-pap、

2、pGenesil-1.0-pap(485)-Pap和pGenesil-1.0-HK-pap，并通過(guò)尾靜脈液壓轉(zhuǎn)基因方法檢測(cè)各檢驗(yàn)載體的作用，篩選出最佳干涉載體pGenesil-1.0-pap(485)。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pEGFP-N1-pap及對(duì)照pEGFP-N1，pGenesil-1.0-pap(485)及對(duì)照pGenesil-1.0-HK等4種質(zhì)粒轉(zhuǎn)入肝癌細(xì)胞BEL-7402內(nèi)，再用G418篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，并進(jìn)行以下檢測(cè)：采

3、用活體觀察和HE染色觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)；細(xì)胞計(jì)數(shù)和MTT法測(cè)定細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線；PCNA細(xì)胞免疫化學(xué)檢測(cè)細(xì)胞增殖；Hoechst33258染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡；甲基纖維素半固體培養(yǎng)基檢測(cè)集落形成率；藥物MTT法檢測(cè)細(xì)胞的耐藥性。為進(jìn)一步研究pap對(duì)肝再生的作用奠定基礎(chǔ)，也為揭示肝再生的分子機(jī)制提供信息。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)采用液壓轉(zhuǎn)基因技術(shù)將pEGFP-N1-pap及對(duì)照pEGFP-N1、pGenesil-1.0-pap(289)和pGenesil-1.0

4、-pap(485)及對(duì)照pGenesil-1.0-HK等5種質(zhì)粒分別注入2/3肝切除后的大鼠肝臟內(nèi)，采用常規(guī)組織學(xué)方法、熒光顯微鏡技術(shù)以及統(tǒng)計(jì)學(xué)方法等檢測(cè)轉(zhuǎn)染這些質(zhì)粒后大鼠的死亡率、組織顯微結(jié)構(gòu)、肝系數(shù)以及肝再生率，以判斷pap對(duì)肝再生的影響。
　　體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-Pap的細(xì)胞明顯成梭形，細(xì)胞核仁增多，與Pap融合的綠色熒光蛋白(EGFP)主要分布在細(xì)胞核核膜周圍，其它轉(zhuǎn)染細(xì)胞株形態(tài)無(wú)明顯變化，EGFP主要

5、分布均在細(xì)胞核中：生長(zhǎng)曲線檢測(cè)顯示轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-Pap質(zhì)粒的細(xì)胞增殖最快；PCNA細(xì)胞免疫化學(xué)和hoechst33258染色檢測(cè)表明穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-pap質(zhì)粒的細(xì)胞可能促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制凋亡；集落形成率結(jié)果顯示穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-pap的細(xì)胞惡性程度升高；藥物MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Pap基因能促進(jìn)BEL-7402細(xì)胞生長(zhǎng)，但對(duì)其耐藥性無(wú)明顯影響。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)入pEGFP-N1-Pap質(zhì)粒后，有炎癥反應(yīng)發(fā)生；在12