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文檔簡介
1、目的 研究角膜新生血管周圍間質(zhì)微環(huán)境與新生血管生長之間的關(guān)系,進一步探討角膜新生血管的發(fā)生機制。 方法 (一)研究角膜新生血管形成時周圍間質(zhì)微環(huán)境的改變 1、建立不同形式的堿燒傷角膜新生血管動物模型(1)單純堿燒傷角膜新生血管模型:選用Wister大鼠8只,將直徑3mm單層圓形濾紙片浸于1mol/LNaoH溶液中15s,濾紙吸出多余的溶液,貼于右眼角膜中央2min,取下濾紙,無菌生理鹽水沖洗1min。(2
2、)板層角膜移植層間新生血管模型:Wister大鼠24只為受體,SD大鼠為供體,建立同種異系板層角膜移植層間新生血管動物模型。隨機分為4組,每組6只,均為右眼手術(shù)。3.0mm環(huán)鉆于Wister鼠角膜中央鉆切,深度達1/3-1/2角膜時,使用尖刀片剝除板層角膜,制作板層角膜植床。3.5mm環(huán)鉆取SD鼠角膜,制作角膜植片,10-0尼龍線間斷縫合8針于已剝除板層角膜的植床。A組:單純剝除角膜內(nèi)皮制作角膜植片。B組:手術(shù)方法同A,植片縫合前,將直
3、徑3mm浸有1mol/LNaoH濾紙片置于角膜植床中央20s,取下濾紙,生理鹽水沖洗30s。C組:角膜植片為從SD大鼠角膜剝下的板層角膜植片。D組:板層角膜植片聯(lián)合NaoH濾紙片燒灼。術(shù)后定期觀察照相及行組織病理學(xué)檢查。 2、免疫組織化學(xué)方法檢測角膜新生血管周圍間質(zhì)的改變堿燒傷Wister大鼠6只,術(shù)后3、5、7天分別處死2只,取角膜。板層角膜移植Wister大鼠2只,術(shù)后15天處死,取角膜。正常Wister大鼠2只,處死取角膜
4、,作為正常對照組。冰凍切片,免疫熒光法檢測兩種新生血管模型中TGF-β1(轉(zhuǎn)化生長因子-β1)、a-SMA(a-平滑肌肌動蛋白)、FAP(成纖維細胞激活蛋白)的表達情況并觀察它們與新生血管之間的關(guān)系。以CD31(血小板內(nèi)皮細胞粘附因子)標記血管內(nèi)皮細胞。 3、分子生物學(xué)方法驗證FAP的表達采用RT-PCR方法檢測FAP在角膜中不同時間及位置的表達。制作4只Wister大鼠右眼堿燒傷血管模型,術(shù)后第3、7天分別處死2只。首先使用3
5、.0mm環(huán)鉆取中央堿燒傷角膜(A區(qū)),然后角鞏膜剪剪下周邊角膜(B區(qū))。對比正常角膜及不同時間AB區(qū)FAP的表達情況。 4、苦味酸天狼猩紅—偏振光法檢測角膜間質(zhì)中主要膠原的改變?nèi)≌4笫蠼悄?、堿燒傷后7天角膜、板層角膜移植術(shù)后15天角膜,石蠟切片,行苦味酸天狼猩紅染色后,應(yīng)用偏振光顯微鏡觀察新生血管角膜中Ⅰ型、Ⅲ型膠原的變化。 5、超微結(jié)構(gòu)檢查取堿燒傷5天及板層角膜移植術(shù)后15天的角膜,行透射電鏡檢查,觀察角膜新生血管形
6、成時間質(zhì)的改變。 (二)間質(zhì)靶分子(FAP)誘導(dǎo)新生血管的研究 大鼠角膜基質(zhì)注射FAP,觀察是否可以誘導(dǎo)角膜新生血管。將18只Wister大鼠隨機分為A、B、C三組,每組6只,均行右眼角膜基質(zhì)注射。A空白對照組注射生理鹽水,5ul;B組注射10ng/ulFAP,5ul;C組注射100ng/ul的FAP,5ul。術(shù)后,定期觀察,記錄新生血管積分,進行統(tǒng)計學(xué)分析。 結(jié)果 (一)角膜新生血管形成時周圍間質(zhì)微環(huán)境
7、的改變 1、動物模型的建立:(1)堿燒傷組:燒傷后1天內(nèi)可見角膜緣血管網(wǎng)擴張充血,第3天時NV已經(jīng)侵入角膜,第7~14天達到生長旺盛期,長入角膜中央,之后血管開始逐漸退縮。病理檢查見血管生長,炎性細胞浸潤。(2)板層角膜移植組:單純剝除角膜植片內(nèi)皮的全厚板層角膜移植聯(lián)合植床堿燒傷的方法成功制作出了層間新生血管模型,術(shù)后1天內(nèi)可見角膜緣血管網(wǎng)擴張充血,第3天時NV已經(jīng)侵入角膜,第7天血管生長到達植片與植床的連接處,15天左右層間新
8、生血管最為旺盛。病理檢查見層間血管生長,炎性細胞浸潤。 2、免疫組織化學(xué)方法檢測角膜新生血管周圍間質(zhì)的改變堿燒傷后7天及板層角膜移植術(shù)后15天的角膜冰凍切片免疫熒光雙染顯示:兩種新生血管動物模型角膜內(nèi)均含有a-SMA、FAP同時陽性的細胞,對照正常角膜無陽性表達。FAP+基質(zhì)細胞位于CD31+的血管內(nèi)皮細胞周圍,與血管內(nèi)皮細胞伴行生長,兩者無明顯的先后順序。同時免疫熒光顯示角膜間質(zhì)TGF-β1陽性表達。 3、分子生物學(xué)方
9、法驗證FAP的表達RT-PCR結(jié)果顯示,正常角膜內(nèi)不含有FAP,堿燒傷3天A區(qū)角膜,不含有FAP;堿燒傷3天B區(qū)角膜,出現(xiàn)FAP。堿燒傷7天A區(qū)角膜,表達FAP;堿燒傷7天B區(qū)角膜,表達FAP。新生血管生長到達的位置,出現(xiàn)FAP陽性表達。 4、苦味酸天狼猩紅—偏振光法檢測角膜間質(zhì)中主要膠原的改變正常大鼠角膜以Ⅰ型膠原含量最多,折射率強,偏光鏡下呈亮黃、橙或紅色粗纖維狀;Ⅲ型膠原,折射率弱,偏光下為細長的綠色纖維。角膜新生血管生長
10、后Ⅰ型、Ⅲ型膠原重新排列以適應(yīng)新生血管的生長。 5、超微結(jié)構(gòu)觀察透射電子顯微鏡下,堿燒傷角膜內(nèi)新生血管生長,炎性細胞浸潤;板層角膜移植層間新生血管生長,炎性細胞浸潤。血管內(nèi)皮細胞周圍被另外一種細胞包繞。 (二)間質(zhì)靶分子誘導(dǎo)新生血管的研究 A組術(shù)后3天角膜緣血管擴張充血,7天時無新生血管長入角膜;B組術(shù)后3天角膜緣血管擴張充血,7天時新生血管開始向注藥區(qū)域生長,14天時長入注藥區(qū)域;C組術(shù)后3天注藥區(qū)域角膜緣有新
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