MEF2C調(diào)控大鼠脊髓背根節(jié)感覺神經(jīng)元細(xì)胞P物質(zhì)和低分子量神經(jīng)絲微管蛋白表達(dá)的研究.pdf

1、目的：建立一種切實(shí)可行的胚胎大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元培養(yǎng)及純化方法，研究MEF2C在背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)表達(dá)對(duì)P物質(zhì)和低分子量神經(jīng)絲微管蛋白基因表達(dá)的影響以及MEF2C與氣道高反應(yīng)性發(fā)生間可能的關(guān)系。 方法：利用顯微解剖獲取足夠數(shù)量的胚胎大鼠背根神經(jīng)節(jié)，通過胰蛋白酶+EDTA消化、交替使用NB培養(yǎng)基與加入了5-氟-2-脫氧尿嘧啶核苷酸/尿苷的抗有絲分裂NB培養(yǎng)基等方法在體外獲得純化的背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元，采用神經(jīng)絲蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色

2、法與DAPI染核的方法鑒定并測定神經(jīng)元的純度。分離培養(yǎng)背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞，然后暴露于不同濃度的NGF下24小時(shí)，最后用實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測P物質(zhì)與低分子量神經(jīng)絲微管蛋白基因在背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。通過化學(xué)轉(zhuǎn)染方法將合成的3條siRNA-Mef2c分別轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞，并用實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)篩選轉(zhuǎn)染效率最高的siRNA。采用化學(xué)轉(zhuǎn)染方法干擾背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)MEF2C的表達(dá)，在高濃度神經(jīng)生長因子刺激背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞

3、后采用實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測干擾后背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)P物質(zhì)與低分子量神經(jīng)絲微管蛋白基因的表達(dá)。 結(jié)果： 1、獲得的背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元在體外生長良好，純度可達(dá)到96％以上。 2、P物質(zhì)及低分子量神經(jīng)絲微管蛋白基因表達(dá)隨刺激用神經(jīng)生長因子濃度的升高而升高。 3、使用化學(xué)轉(zhuǎn)染方法成功的干擾了背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)MEF2C的表達(dá)，Mef2c較對(duì)照組下降50％，同時(shí)沒有檢測到對(duì)Creb表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)組背根神

4、經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)P物質(zhì)在RNA水平較對(duì)照組下降了41％，而低分子量神經(jīng)絲微管蛋白在RNA水平較對(duì)照組下降了61％。 結(jié)論： 1、本實(shí)驗(yàn)原代培養(yǎng)方法能獲得大量高度純化的大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元。 2、神經(jīng)生長因子促進(jìn)大鼠脊髓背根節(jié)感覺神經(jīng)元內(nèi)P物質(zhì)與低分子量神經(jīng)絲微管蛋白的合成。 3、胚大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)P物質(zhì)及低分子量神經(jīng)絲微管蛋白基因表達(dá)受到MEF2C的調(diào)控， MEF2C可能是參與了氣道高反應(yīng)性發(fā)生