小檗胺誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡與p210bcr-abl蛋白磷酸化和Hsp90表達(dá)的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、背景:慢性粒細(xì)胞白血病(CML)是一種常見的造血系統(tǒng)惡性腫瘤,由Ph染色體產(chǎn)生的p210bcr/abl癌性融合蛋白在慢粒惡性表型中起著十分重要的作用。已知,p210bcr/abl癌性融合蛋白必需磷酸化才能發(fā)揮其促進腫瘤細(xì)胞增殖、存活以及抑制腫瘤細(xì)胞凋亡等生物學(xué)功能,而熱休克蛋白90(Hsp90)是p210bcr/abl癌性融合蛋白重要分子伴侶。Gleevec(又稱STI571,Imatinib)是一種能抑制bcr/abl癌性融合蛋白磷酸

2、化而誘導(dǎo)Ph染色體陽性白血病細(xì)胞凋亡的靶向性抗白血病藥物。然而,隨著Gleevec在臨床的廣泛應(yīng)用,發(fā)現(xiàn)有相當(dāng)一部分白血病患者對Gleevec產(chǎn)生抗藥性而失去療效。因此,尋找新的bcr/abl癌性融合蛋白抑制劑仍然十分必要。我們新近的研究發(fā)現(xiàn),在臨床上應(yīng)用的升白細(xì)胞藥物小檗胺能抑制p210bcr/abl癌性融合蛋白陽性白血病細(xì)胞系K562及CML患者原代白血病細(xì)胞的生長并誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡,并且對Gleevec耐藥的K562細(xì)胞的生長同

3、樣具有明顯的抑制作用,但其作用分子機制仍不十分清楚。本研究應(yīng)用體外細(xì)胞培養(yǎng)體系、流式細(xì)胞術(shù)、免疫印跡和免疫共沉淀等技術(shù)和方法,觀察小檗胺對白血病細(xì)胞系K562細(xì)胞p210bcr/abl癌性融合蛋白磷酸化及其分子伴侶Hsp90等的影響,以探討小檗胺誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡分子機制。 材料與方法:培養(yǎng)表達(dá)內(nèi)源性p210bcr/abl蛋白的Ph+人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系K562,用小檗胺按指定時間和劑量干預(yù)細(xì)胞。應(yīng)用MTT法檢測細(xì)胞活力,求

4、出小檗胺對K562細(xì)胞的48hIC50濃度;應(yīng)用AnnexinV-FLUOS/PI試劑盒和流式細(xì)胞術(shù)定量分析早期亡細(xì)胞百分比;用cytoperm/cytofix和Caspase-3-McAb-PE定量檢測含活化半胱天冬酶-3(Caspase-3)細(xì)胞百分比;以免疫共沉淀技術(shù)(c-abl抗體)和Western印跡[p-Tyr(pY99)抗體]定量分析p210bcr/abl蛋白磷酸化;p210bcr/abl蛋白總量直接用Western印跡(

5、c-abl抗體)檢測;Hsp90和Hsp70等分子伴侶蛋白水平的變化用Western印跡(Hsp90和Hsp70抗體)檢測。 結(jié)果:(1)小檗胺作用K562白血病細(xì)胞48h,其50%細(xì)胞生存受抑時的半數(shù)抑制濃度(IC50)為8.1μg/ml。 (2)8μg/ml濃度小檗胺作用48h后,45.69%K562白血病細(xì)胞表達(dá)活化的Caspase-3凋亡分子和48.43%K562白血病細(xì)胞發(fā)生凋亡。 (3)免疫印跡和免疫

6、共沉淀結(jié)果顯示,低劑量小檗胺可明顯抑制K562白血病細(xì)胞內(nèi)p210bcr/abl蛋白磷酸化:8μg/ml濃度小檗胺處理6h后,K562細(xì)胞磷酸化p210bcr/abl蛋白含量僅為對照組的8.41%,而p210bcr/abl蛋白總量并無變化。 (4)小檗胺還能直接下調(diào)p210bcr/abl分子伴侶Hsp90蛋白水平:K562白血病細(xì)胞經(jīng)8μg/ml濃度小檗胺處理24h時的Hsp90水平只有對照組的18.37%,而且對能誘導(dǎo)白血病細(xì)

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