ING5、CXCL16-CXCR6在胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移中的作用及相關(guān)分子機(jī)理研究.pdf

1、第一部分，目的:
　　 胃癌是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,雖然近年發(fā)病率有所下降,但仍然嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康。雖然化療、放療、生物治療和基因治療在胃癌治療中廣泛應(yīng)用,但胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移仍然是生存率無(wú)法大幅提升的主要原因。近年來(lái)分子遺傳學(xué)研究證明,胃癌是異型性極強(qiáng)的惡性腫瘤,胃癌發(fā)生和發(fā)展是多階段、多基因和多因素參與的復(fù)雜過(guò)程,這些基因主要包括癌基因、抑癌基因及DNA錯(cuò)配修復(fù)基因等。其中基因突變、雜合性丟失和啟動(dòng)子甲基化修飾等導(dǎo)致抑癌基

2、因功能降低或缺失在腫瘤發(fā)生和演進(jìn)中發(fā)揮重要作用,成為腫瘤學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn),其中之一就是生長(zhǎng)抑制基因(Inhibitorofgrowth,ING)家族。
　　 生長(zhǎng)抑制基因(ING)包括5個(gè)家族成員。其中,ING5定位于人染色體2q37.3,含有8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子,編碼長(zhǎng)為5233bp的cDNA中1068個(gè)核苷酸翻譯成由240個(gè)氨基酸組成的28kDa蛋白質(zhì)。從氨基到羧基末端ING5蛋白含有亮氨酸拉鏈樣(LZL)、新保守區(qū)(NC

3、R)、核定位序列(NLS)和植物同源結(jié)構(gòu)域(PHD)。LZL結(jié)構(gòu)域在DNA修復(fù)、凋亡誘導(dǎo)和染色質(zhì)重建中發(fā)揮重要作用,NCR結(jié)構(gòu)域在基因表達(dá)和染色質(zhì)重建過(guò)程中參與組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HAT)復(fù)合體形成,NLS結(jié)構(gòu)域決定了ING5蛋白核定位。因其具有抑制細(xì)胞生長(zhǎng)并以p53蛋白依賴(lài)方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的生物學(xué)作用,ING5被認(rèn)為是一種抑癌基因。ING5可誘導(dǎo)p53蛋白乙酰化,在乙?；痯53蛋白協(xié)同作用下形成HAT復(fù)合體或激活微染色體維持蛋白(MCM

4、),分別在調(diào)節(jié)細(xì)胞S期DNA復(fù)制或組蛋白乙?；邪l(fā)揮作用。有研究顯示,ING5可以通過(guò)調(diào)節(jié)p53蛋白激活周期素依賴(lài)激酶抑制劑p21/waf1啟動(dòng)子活性促進(jìn)p21其表達(dá),進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞G1期阻滯。
　　 很多研究發(fā)現(xiàn),惡性腫瘤發(fā)生過(guò)程中存在ING蛋白下調(diào)或者缺失,癌細(xì)胞中ING表達(dá)參與凋亡調(diào)節(jié)。許多體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)ING蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的作用。ING5的過(guò)表達(dá)可以導(dǎo)致集落形成效能的降低和S期細(xì)胞的減少,并且以P53依賴(lài)的方式誘導(dǎo)細(xì)胞

5、凋亡。我們之前的研究顯示結(jié)腸癌中ING5蛋白或mRNA組織含量升高,兩者癌變過(guò)程中核ING5蛋白發(fā)生了漿移動(dòng)和表達(dá)下調(diào),核ING5表達(dá)與腫塊大小、侵襲深度、去分化、臨床病理分期或不良預(yù)后呈負(fù)相關(guān),而漿ING5表達(dá)與腫瘤侵襲深度、淋巴管侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或臨床病理分期呈正相關(guān)。
　　 隨著診斷和治療技術(shù)的不斷提高和廣泛開(kāi)展,胃癌的發(fā)病率和病死率在全世界范圍均有所下降,但是胃癌仍是威脅人類(lèi)的高發(fā)惡性腫瘤之一,而且病死率仍排在第二位。病

6、理和遺傳學(xué)研究提示胃黏膜上皮不典型增生大部分最終要惡變,然而,其分子機(jī)制尚未闡明。因此,我們推測(cè)ING5表達(dá)異常在胃癌發(fā)生和演進(jìn)中發(fā)揮重要作用。本文研究了ING5在胃正常粘膜、不典型增生、癌組織和胃癌細(xì)胞系中的表達(dá),并進(jìn)行臨床病理學(xué)資料分析和預(yù)后分析,以期發(fā)現(xiàn)ING5在胃癌進(jìn)展過(guò)程中作用。
　　 方法：
　　 一、細(xì)胞培養(yǎng):
　　 五種胃癌細(xì)胞系,MKN28(高分化腺癌)、MKN45(低分化腺癌)、AGS(中分化

7、腺癌)、KATO-Ⅲ(低分化腺癌)和GT-3(未分化腺癌)受贈(zèng)于日本理化研究所。其中,MKN28、MKN45和KATO-Ⅲ在ERPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng),GT-3在DMEM@培養(yǎng),AGS在Hams/F-12中培養(yǎng),每種培養(yǎng)液中均加10%FBS,濃度為100units/ml。所有細(xì)胞經(jīng)過(guò)收集、離心、PBS洗滌,然后提取總蛋白。細(xì)胞蛋白在應(yīng)用核漿蛋白分離試劑盒分離(78833;PierceBiotechnology,Rockford,IL

8、)。再次收集細(xì)胞,經(jīng)過(guò)離心、PBS洗滌后,置入10%甲醛中固定,然后進(jìn)行石蠟包埋,用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。
　　 二、胃癌標(biāo)本的收集
　　 胃癌石蠟標(biāo)本來(lái)自于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤外科1985年至2003年手術(shù)切除病例和KousereinTakaokaHospital1993年至2002年的手術(shù)切除病例,其中胃癌組織(GC)429例,癌旁非癌組織(NNM)119例。另外還有50例不典型增生來(lái)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)窺鏡

9、中心1990年至2009年的活檢標(biāo)本。另外還收集臨床手術(shù)新鮮標(biāo)本21例,包括癌組織和相對(duì)應(yīng)的癌旁非癌組織,標(biāo)本置于-80℃深低溫冰箱保存直至實(shí)驗(yàn)所用。所有病例術(shù)前均未經(jīng)過(guò)放化療和其他輔助治療。我們對(duì)每例患者進(jìn)行電話(huà)隨訪(fǎng)。
　　 三、病理學(xué)檢查及組織芯片(tissuemicroarray,TMA)的制備
　　 所有蠟塊均切成4-μm厚的切片,然后進(jìn)行HE染色,鏡下確定組織學(xué)診斷和其他鏡下特點(diǎn)。鏡下確定每例切片的目的區(qū)域,然

10、后再組織芯片機(jī)上制成2mm直徑組織,放于組織芯片盒內(nèi)(TMA;AZUMAYAKIN-1,Tokyo,Japan),之后對(duì)芯片盒內(nèi)的組織在進(jìn)行石蠟包埋,最后切成4-μm的切片進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)。
　　 四、蛋白印記(Westernblot)檢測(cè)ING5的蛋白水平
　　 (1)將收集的病理標(biāo)本,加裂解液(20mmol/LTris/HclPH:7.5,50mmol/LNacl,0.1mmol/LNa3Vo4,25mmol/LNa

11、F,2mmol/LEDTA/EGTA,1mmol/LDTT,1mgl/L亮肽酶/抑肽酶)200μL,冰上放置30min,超聲破碎20sec/次,3-4次。12000rpm離心20min取上清,即為總蛋白。
　　 (2)收集細(xì)胞,用預(yù)冷的PBS洗滌2次,1000rpm/min離心5min棄上清。同上方法提取總蛋白。
　　 (3)考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量,取90μg總蛋白上樣,經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白后將蛋白

12、電轉(zhuǎn)移到NC膜上。根據(jù)分子量裁膜。5%脫脂奶粉室溫封閉1h,加入ING5一抗(1:1000)4℃過(guò)夜,辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗室溫作用1h。每次孵育后均用含5%的Tween-20的TBS洗脫3次,每次5min。待NC膜稍干后,在膜上滴加適量的ECL顯影并上機(jī)掃描測(cè)灰度值。每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。(4)最后,StrongBuffer液洗膜,在加入內(nèi)參β-actin單克隆抗體(1:1000)孵育,按上述步驟顯影并測(cè)灰度值,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

13、>　　 五、RT-PCR、電泳&測(cè)序
　　 以提取并反轉(zhuǎn)錄的cDNA#3模板擴(kuò)增目的基因:25μL反應(yīng)體系含有Taq酶0.125μL和100ng模板cDNA。反應(yīng)條件:95℃變性10分鐘在經(jīng)過(guò)32個(gè)周期95℃變性30秒,60℃(ING5)/55℃(β-actin)退火45秒,72℃延伸1分鐘,最后一次延伸7分鐘。擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳,UVP凝膠成像檢測(cè),檢測(cè)灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。最后,將PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收(QI

14、AGEN試劑盒),然后進(jìn)行測(cè)序。
　　 六、實(shí)時(shí)RT-POR
　　 為了進(jìn)一步確定RT-PCR的結(jié)果,我們又進(jìn)行了實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)。兩步法擴(kuò)增目的基因,95℃30s進(jìn)行預(yù)變性;95℃5s,60℃34s40個(gè)循環(huán)進(jìn)行PCR反應(yīng)。20μL反應(yīng)體系含有10μLSYBRPremixExTaq酶,0.08μL引物和0.4μLofROXReferenceDye和1μL模板cDNA。反應(yīng)結(jié)束后獲取Ct值,并根據(jù)2-△△Ct進(jìn)行計(jì)算

15、得出比例。
　　 七、免疫組化
　　 將切片先用2甲苯脫蠟,用酒精脫水,在進(jìn)行抗原修復(fù)(微波爐高溫高壓法,抗原修復(fù)液選用pH值6.0的檸檬酸鈉緩沖液)。然后用3%H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,再用5%BSA阻斷非特異性結(jié)合。之后用ING5抗體孵育4℃過(guò)夜(1:100),第二天用二抗孵育1小時(shí),最后用DAB顯色,蘇木精復(fù)染,然后常規(guī)進(jìn)行脫水、透明、封片。每次孵育前均在微波爐中雜交30分鐘,每次處置前均用TBST洗三次。不加

16、一抗做為陰性對(duì)照。
　　 結(jié)果：
　　 一、ING5在五種胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)
　　 通過(guò)蛋白印記和免疫組化,我們發(fā)現(xiàn)ING5在胃癌五種細(xì)胞系的細(xì)胞核中均有表達(dá)。為了從mRNA水平進(jìn)一步驗(yàn)證,我們對(duì)五種胃癌細(xì)胞的RNA進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)ING5mRNA在五種胃癌細(xì)胞系中均有表達(dá),且表達(dá)水平相似。進(jìn)一步,我們將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)1NG5是否存在突變。
　　 二、INGS5在胃癌組織中的表達(dá)

17、r>　　 在18例胃癌新鮮組織及對(duì)應(yīng)正常粘膜中檢測(cè)蛋白水平,發(fā)現(xiàn)6例(33.3%)癌組織高于正常,8例(44.4%)低于正常,4例(22.2%)無(wú)差別。經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示,在蛋白水平癌組織和正常粘膜的ING5表達(dá)無(wú)差別。進(jìn)一步,我們又對(duì)15例標(biāo)本進(jìn)行了mRNA水平的檢測(cè),結(jié)果顯示,12例(80%)癌組織高于正常,1例低于正常,2例無(wú)差別。經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示,在mRNA水平癌組織和正常粘膜的ING5表達(dá)有顯著差別。我們又進(jìn)行了實(shí)時(shí)RT-

18、PCR,證實(shí)了我們的結(jié)果。
　　 三、ING5的表達(dá)與胃癌患者臨床病理學(xué)因素的關(guān)系以及生存分析
　　 核ING5的表達(dá)與腫瘤大小、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和UICC分期呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05),與性別、淋巴管浸潤(rùn)和靜脈浸潤(rùn)無(wú)關(guān)(P＞0.05)。核ING5在老年患者中的表達(dá)要高于年輕患者(P＜0.05)。相對(duì)應(yīng),漿ING5的表達(dá)與浸潤(rùn)深度、靜脈浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和UICC分期呈正相關(guān)(P＜0.05),而與腫瘤大小、性別、年齡、淋

19、巴管浸潤(rùn)和核ING5表達(dá)無(wú)關(guān)(P＞0.05)。與彌漫性胃癌相比,腸型胃癌中的核ING5高表達(dá),而漿ING5正相反。
　　 我們對(duì)343例胃癌患者進(jìn)行了隨訪(fǎng)(0.4個(gè)月-9.3年,平均78.0個(gè)月)。生存分析應(yīng)用K-M法,單因素分析結(jié)果顯示核ING5的表達(dá)與患者的累計(jì)生存期呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05),而漿ING5無(wú)關(guān)(P＞0.05)。進(jìn)一步經(jīng)過(guò)Cox回歸分析,結(jié)果提示核ING5的表達(dá)并不是影響胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P＞0.05

20、)。浸潤(rùn)深度、UICC分期和Lauren分型是影響核ING5和胃癌患者預(yù)后關(guān)系的因素。
　　 結(jié)論：
　　 1.ING5蛋白表達(dá)參與胃癌發(fā)生的早期階段,并且影響胃癌的生物學(xué)行為;
　　 2.ING5的核漿移動(dòng)對(duì)胃癌的生物學(xué)行為起到重要作用;
　　 3.但是,胃癌中核ING5蛋白漿移動(dòng)的分子機(jī)制還不清楚,有待進(jìn)一步研究。
　　第二部分， 目的：
　　 胃癌是我國(guó)發(fā)病率和死亡率較高的惡性腫瘤之

21、一,各種化療和基因生物治療也效果不佳,胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移是生存率明顯降低的主要原因。近年來(lái)分子遺傳學(xué)研究證明胃癌是異型性極強(qiáng)的惡性腫瘤,其侵襲和轉(zhuǎn)移是多階段多基因參與的結(jié)果,已經(jīng)闡明的分子機(jī)制仍然無(wú)法解釋所有的發(fā)生事件。因此深入研究胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制,尋找新的分子治療靶點(diǎn),將有助于提高療效,并為分子分型和分子分期提供線(xiàn)索。
　　 化學(xué)趨化因子屬于小分子分泌細(xì)胞因子,其主要的作用是可以促進(jìn)各種白細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)。由于白細(xì)胞的定向運(yùn)動(dòng)

22、與腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移十分相似,人們更加關(guān)注其在腫瘤侵潤(rùn)、轉(zhuǎn)移中的作用。目前,已有大量研究證實(shí)化學(xué)趨化因子在各種腫瘤細(xì)胞中的表達(dá),并進(jìn)一步顯示其在腫瘤進(jìn)展和器官選擇性轉(zhuǎn)移中的作用。
　　 CXCL16是新近發(fā)現(xiàn)的一種趨化因子,人類(lèi)CXCL16基因定位于染色體17p13上,與已知的其它趨化因子相隔。CXCL16是唯一一個(gè)以?xún)煞N存在形式的趨化因子:膜結(jié)合型和分泌型。CXCL16是繼Fractalkine之后第二個(gè)以膜結(jié)合的方式存在的

23、趨化因子,它在以跨膜結(jié)合的形式表達(dá)于樹(shù)突狀細(xì)胞表面時(shí),可起到細(xì)胞表面的粘附分子的作用,與其它粘附分子協(xié)作介導(dǎo)與表達(dá)CXCR6的T細(xì)胞和NKT細(xì)胞結(jié)合。在ADAM10的分裂剪切作用下,膜結(jié)合型的CXCL16可脫落形成具有趨化活性的可溶性形式,招募表達(dá)CXCR6的活化的T細(xì)胞和NKT細(xì)胞。在目前已知的所有的趨化因子受體中,只有CXCR6是CXCL16的唯一受體。CXCR6是一個(gè)7次跨膜G蛋白偶聯(lián)受體,含有7段跨膜區(qū),基因位于第3號(hào)染色體上。

24、
　　 化學(xué)趨化因子及其受體在腫瘤的生長(zhǎng)、侵潤(rùn)、血管形成和轉(zhuǎn)移中起到了重要的作用,這一點(diǎn)已經(jīng)得到眾多學(xué)術(shù)團(tuán)體的認(rèn)可,因此,探討CXCL16、CXCR6與惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系及相關(guān)分子生物學(xué)機(jī)理不但可以推動(dòng)惡性腫瘤病因?qū)W和治療學(xué)的發(fā)展,而且可為惡性腫瘤靶向化療藥物研發(fā)和基因治療提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：
　　 一、細(xì)胞培養(yǎng):
　　 九種胃癌細(xì)胞系,MGC-803、BGC-823、MKN28、MK

25、N45、AGS、KATO-Ⅲ、SGC-7901、HGC-27和GES-1。其中,MGC-803、BGC-823、MKN28、MKN45和KATO-Ⅲ在RFMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng),GES-1和SGC-7901在DMEM中培養(yǎng),AGS在Hams/F-12中培養(yǎng),HGC-27在MEM中培養(yǎng),每種培養(yǎng)液中鈞加10%FBS,濃度為100units/ml。所有細(xì)胞經(jīng)過(guò)收集、離心、PBS洗滌,然后提取總蛋白。再次收集細(xì)胞,經(jīng)過(guò)離心、PBS洗滌后,置

26、入10%甲醛中固定,然后進(jìn)行石蠟包埋,用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。
　　 二、胃癌標(biāo)本的收集
　　 胃癌石蠟標(biāo)本來(lái)自于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤外科1985年至2003年手術(shù)切除病例和KousereinTakaokaHospital1993年至2002年的手術(shù)切除病例,其中胃癌組織(GC)429例,癌旁非癌組織(NNM)119例。50例不典型增生來(lái)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)窺鏡中心1990年至2009年的活檢標(biāo)本。另外還收集臨床

27、手術(shù)新鮮標(biāo)本28例,包括癌組織和相對(duì)應(yīng)的癌旁非癌組織,標(biāo)本置于-80℃深低溫冰箱保存。所有病例術(shù)前均未經(jīng)過(guò)放化療和其他輔助治療。我們對(duì)每例患者進(jìn)行電話(huà)隨訪(fǎng)。
　　 三、病理學(xué)檢查及組織芯片(tissuemicroarray,TMA)的制備
　　 所有蠟塊均切成4-μm厚的切片,然后進(jìn)行HE染色,鏡下確定組織學(xué)診斷和其他鏡下特點(diǎn)。胃癌分期按照UICC標(biāo)準(zhǔn)。組織學(xué)類(lèi)型按照Lauren分型標(biāo)準(zhǔn)。另外,同時(shí)觀察腫瘤的浸潤(rùn)深度、淋

28、巴管及靜脈浸潤(rùn)。
　　 鏡下確定每例切片的目的區(qū)域,然后再組織芯片機(jī)上制成2mm直徑組織,放于組織芯片盒內(nèi),之后對(duì)芯片盒內(nèi)的組織在進(jìn)行石蠟包埋,最后切成4-μm的切片進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)。
　　 四、蛋白印記(Westernblot)檢測(cè)CXCR6的蛋白水平
　　 (1)將收集的病理標(biāo)本,加裂解液(20mmol/LTris/HclPH:7.5,50mmol/Lnacl,0.1mmol/LNa3Vo4,25mmol/L

29、NaF,2mmol/LEDTA/EGTA,1mmol/LDTT,1mgl/L亮肽酶/抑肽酶)200μL,冰上放置30min,超聲破碎20sec/次,3-4次。12000rpm離心20min取上清,即總蛋白。
　　 (2)收集細(xì)胞,用預(yù)冷的PBS洗滌2次,1000rpm/min離心5min棄上清。按照上述方法提取總蛋白。
　　 (3)考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量,取90μg總蛋白上樣,經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白后

30、將蛋白電轉(zhuǎn)移到NC膜上。根據(jù)分子量裁膜。5%脫脂奶粉室溫封閉1h,加入CXCR6一抗4℃過(guò)夜,辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗室溫作用1h。每次孵育后均用含5%的Tween-20的TBS洗脫3次,每次5min。待NC膜稍干后,在膜上滴加適量的ECL顯影并上機(jī)掃描測(cè)灰度值。
　　 (4)最后,StrongBuffer液洗膜,在加入內(nèi)參β-actin單克隆抗體(1:1000)孵育,按上述步驟顯影并測(cè)灰度值,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 五、

31、RT-PCR、電泳&測(cè)序
　　 以提取并反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板,擴(kuò)增目的基因:25μL反應(yīng)體系含有Taq酶0.125μL和100ng模板cDNA。反應(yīng)條件:94℃變性2分鐘在經(jīng)過(guò)33個(gè)周期94℃變性30秒,58℃/55℃(β-actin)退火30秒,72℃延伸30秒,最后一次延伸10分鐘。擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳,UVP凝膠成像檢測(cè),檢測(cè)灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。最后,將PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收((QIAGEN試劑盒),然后進(jìn)

32、行測(cè)序。
　　 六、ELISA
　　 收集胃癌患者血清及細(xì)胞培養(yǎng)液上清,經(jīng)過(guò)離心后-80℃保存。購(gòu)置人CXCL16ELISA試劑盒,按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行CXCL16分泌蛋白的檢測(cè)。
　　 七、MTT比色法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)
　　 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胃癌細(xì)胞AGS和SGC-7901,制成單細(xì)胞懸液,以每孔1×105個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中,每孔200μL培養(yǎng)液,培養(yǎng)細(xì)胞24h。加入濃度CXCL16濃度分別為0μmol/

33、L,50μmol/L,100μmol/L,150μmol/L,200μmol/L,每組3個(gè)復(fù)孔,并設(shè)空白孔。作用48h后,每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20μl,37℃繼續(xù)孵育4h,終止培養(yǎng)。選擇490nm波長(zhǎng),酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔光吸收值,以藥物濃度為橫軸,細(xì)胞增殖比率為縱軸繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)。
　　 八、細(xì)胞侵襲分析
　　 在小室濾膜(8um孔徑)的內(nèi)面鋪以10ug的ECM膠,4℃冰箱過(guò)夜,形成一個(gè)基質(zhì)屏障層。在

34、孔培養(yǎng)板內(nèi)加入600ul正常培養(yǎng)液。收集上述細(xì)胞,重懸于培養(yǎng)基中,終濃度為5×105/ml。將細(xì)胞懸液加到上室內(nèi),每小室100ul。正常條件培養(yǎng)24h。將小室取出,濾膜用甲醇固定1h。后用吉姆薩染色,顯微鏡下照相并計(jì)數(shù)。
　　 九、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期
　　 在含濃度為150μmol/LCXCL16的培養(yǎng)基中,培養(yǎng)上述兩種細(xì)胞。離心2000r/min,5min,棄上清后加入2mLPBS重復(fù)離心一次。用0.5mlPBS重

35、懸細(xì)胞至單細(xì)胞懸液,并使其迅速在4℃預(yù)冷的75%的乙醇溶液中固定,之后在4℃下離心2000r/min,5min,棄上清后加入5mL冷PBS再離心一次,棄去上清。在避光條件下加入1mLPI染液重懸細(xì)胞至單細(xì)胞懸液,室溫孵育30min,用流式細(xì)胞儀分析樣品。
　　 結(jié)果：
　　 一、OXOL16、CXOR6在胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)
　　 通過(guò)RT-PCR篩選,我們發(fā)現(xiàn)CXCL16和CXCR6在九種胃癌細(xì)胞系中均有表達(dá),且

36、表達(dá)水平相似。
　　 二、CXCR6在組織中的蛋白表達(dá)水平
　　 在27例胃癌新鮮組織及對(duì)應(yīng)正常粘膜中檢測(cè)蛋白水平,發(fā)現(xiàn)17例(63.O%)癌組織高于正常,5例(18.5%)低于正常,5例(18.5%)無(wú)差別。經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示,在蛋白水平癌組織和正常粘膜的CXCR6表達(dá)有顯著差別。
　　 三、CXCL16和CXCR6在組織中的mRNA表達(dá)水平
　　 在28例胃癌新鮮組織及對(duì)應(yīng)正常粘膜中檢測(cè)CXCL16和

37、CXCR6mRNA表達(dá)水平。CXCL16的結(jié)果顯示,18例(64.3%)癌組織高于正常,3例低于正常,7例無(wú)差別;而CXCR6的結(jié)果顯示,6例癌組織高于正常,18例(64.3%)低于正常,4例無(wú)差別。經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示,CXCL16mRNA水平癌組織高于正常粘膜的表達(dá),結(jié)果有顯著差別,而CXCR6mRNA水平癌組織低于正常粘膜的表達(dá),結(jié)果也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 四、胃癌患者血清及細(xì)胞上清中CXCL16含量的檢測(cè)
　　 我

38、們將胃癌患者的血清按說(shuō)明書(shū)步驟加入ELISA試劑盒并進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果與患者的臨床病理學(xué)指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分,結(jié)果顯示,患者血清中CXCL16的分泌與患者的年齡、淋巴管浸潤(rùn)和Lauren分型相關(guān)(P＜0.05)。
　　 之前經(jīng)過(guò)篩選,CXCL16在每種胃癌細(xì)胞系中都有表達(dá),我們選擇兩種細(xì)胞AGS和SGC-7901,通過(guò)ELISA的方法檢測(cè)CXCL16在IL-1β和TNFα誘導(dǎo)下的分泌情況。結(jié)果顯示,IL-1β和TNFα均能顯著提高兩種細(xì)

39、胞分泌CXCL16的量,并且呈現(xiàn)濃度依賴(lài)方式,即隨IL-1β和TNFα濃度的增加,CXCL16分泌的濃度也逐漸增加。
　　 五、MTT比色法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)
　　 MTT結(jié)果顯示隨著CXCL16濃度加大,兩種細(xì)胞的活力均逐漸增加,而且呈現(xiàn)濃度依賴(lài)方式。
　　 六、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡
　　 AGS和7901隨CXCL16的濃度增加,凋亡逐漸減少
　　 七、細(xì)胞侵襲分析
　　 AGS和79

40、01隨CXCL16的濃度增加,侵襲力逐漸增加(P＜0.05)。
　　 八、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期
　　 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期,結(jié)果顯示兩種細(xì)胞隨著CXCL16濃度的增加,G2期細(xì)胞比例逐漸增加。
　　 結(jié)論：
　　 1.CXCL16/CXCR6與胃癌的侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān),而且影響胃癌細(xì)胞的生物學(xué)行為;
　　 2.許多細(xì)胞因子如IL-1β、TNFα影響CXCL16的分泌,從而促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移;<