STAT3在胃癌腹膜種植轉(zhuǎn)移中的作用及機理研究.pdf

1、目的：胃癌的轉(zhuǎn)移復發(fā)是其發(fā)生和演進過程中最危險階段。隨著人們對胃癌轉(zhuǎn)移規(guī)律的深入了解，并由此開展胃癌擴大性淋巴結(jié)清掃術(shù)、聯(lián)合臟器切除術(shù)以來，術(shù)后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性復發(fā)和局部復發(fā)率有了較大程度的降低。但胃癌術(shù)后因腹膜遭癌細胞種植而復發(fā)的嚴重性卻日漸突出，并成為治療中最大障礙之一。文獻報道在胃癌術(shù)后復發(fā)的類型中，腹膜種植約占50％，為導致多數(shù)患者死亡的主要原因，目前其發(fā)生機制尚不明確，且缺乏行之有效的防治手段。JAK-STAT(Janus kin

2、ase-slgnal transducer andactivator of transcription)是近來頗受關(guān)注的一條信號傳導通路。研究發(fā)現(xiàn)STAT3的異常活化與乳腺癌、前列腺癌以及肺癌等多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，腫瘤細胞可能通過活化的STAT3信號影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展進程，該信號傳導途徑與胃癌的相關(guān)性是最近為人們所認識的，但該信號途徑是否也影響到胃癌腹膜種植這一關(guān)鍵性病理過程，又是通過何種方式調(diào)控哪些下游信號誘導胃癌細胞出現(xiàn)侵

3、襲轉(zhuǎn)移表型，其具體機制目前尚不清楚。為此，本課題擬首先觀察胃癌患者腹水或腹腔沖洗液中細胞STAT3表達及其與胃癌臨床病理參數(shù)及手術(shù)方式的關(guān)系，隨后將STAT3誘餌寡核苷酸(decoyoligonucleotide)經(jīng)脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)染胃腺癌細胞株MKN45，特異性抑制胞核內(nèi)活化的p-STAT3蛋白，觀察其阻抑效應；并最終建立胃癌裸鼠腹膜種植模型，觀察胃癌細胞腹膜種植能力及腹膜種植轉(zhuǎn)移過程相關(guān)調(diào)控因子的變化情況，由此力圖揭示STAT3信號在胃

4、癌腹膜種植過程的作用方式及機理，為胃癌腹膜種植轉(zhuǎn)移防治提供新思路和實驗依據(jù)。 方法：(1)收集66例胃癌患者腹水或者腹腔沖洗液及12例胃良性疾病患者的腹腔沖洗液標本，應用腹腔沖洗細胞學檢查其中的游離癌細胞，應用巢式RT-PCR方法檢測腹腔沖洗液中CEAmRNA和STAT3 mRNA表達，系統(tǒng)分析并比較CEAmRNA、STAT3 mRNA表達與漿膜受侵、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、胃癌臨床病理分期(TNM)、病理分化類型等病理因素以及采取的手術(shù)方

5、式的相關(guān)性；(2)將特異性的STAT3 Decoy ODN轉(zhuǎn)染胃腺癌MKN45細胞并予以鑒定，采用凝膠阻滯電泳(EMSA)和Western blot方法觀察轉(zhuǎn)染前后MKN45細胞中STAT3的DNA結(jié)合活性和磷酸化STAT3蛋白表達情況，明確STAT3受抑程度；(3)建立人胃癌細胞裸鼠腹膜移植模型，觀察STAT3 Decoy ODN轉(zhuǎn)染對胃癌細胞裸鼠腹膜種植轉(zhuǎn)移能力的影響；同時觀察轉(zhuǎn)染后胃癌細胞在生長活力、粘附特性和體侵襲能力方面的改變

6、情況；并應用流式細胞法、免疫組化方法檢測各組細胞間E-cadherin、ICAM-1、CD44v6、MMP-2和MMP-9等蛋白表達的差異。 結(jié)果：(1)PLc檢測陽性率為31.8％，巢式RT-PCR檢測CEA mRNA和STAT3 mRNA陽性率分別為48.48％和43.94％。CEA mRNA及STAT3 mRNA的陽性檢出率與PLC相比較有顯著性差異(P=0.000)。胃癌患者腹腔沖洗液CEA mRNA和STAT3 mRN

7、A表達與腫瘤分化程度(P<0.05)、浸潤深度(P<0.01)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.01)和TNM分期有關(guān)(P<0.05)，而與腫瘤的大小無關(guān)(P>0.01)；腹腔沖洗液中胃癌細胞STAT3 mRNA的表達與CEA mRNA表達呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)(r=0.999，P<0.001)。比較開腹組與腔鏡手術(shù)組標本CEA mRNA和STAT3 mRNA表達無顯著性差異(P<0.05)。(2)STAT3 Decoy ODN轉(zhuǎn)染MKN45細胞后，細胞

8、生長受到明顯地抑制，抑制作用呈現(xiàn)時間依賴性；轉(zhuǎn)染后細胞周期分布中，G<,0>/G<,1>期比例增高，而S期和G<,2>/M期比例降低，細胞的增殖指數(shù)亦明顯降低(P<0.05)。胃癌細胞轉(zhuǎn)染STAT3：Decoy ODN后，胞核內(nèi)活化形態(tài)的p-STAT3蛋白表達與對照組相比無顯著性差異(P>0.05)。而STAT3的DNA結(jié)合能力與對照組相比有明顯的差別。(3)建立各轉(zhuǎn)染組胃癌細胞的裸鼠腹膜轉(zhuǎn)移模型，STAT3 Decoy ODN轉(zhuǎn)染組與

9、對照組裸鼠比較，腹水產(chǎn)生時間、腹水量均有顯著性差異(P<0.05)；兩組的腹膜種植瘤最大直徑、最大重量和種植瘤數(shù)目相比，亦均有顯著性差異(P<0.05)，Decoy ODN轉(zhuǎn)染組腫瘤抑制率為42％；兩組裸鼠的：荷瘤生存時間、生存率、生命延長率相比有顯著差異(P<0.01或P<0.05)；種植瘤細胞周期分布情況：STAT3 Decoy ODN組與對照組細胞比較，G<,0>/G<,1>期比例增高，而s期和G<,2>/M期比例降低，細胞的增殖

10、指數(shù)降低。轉(zhuǎn)染Decoy ODN后的胃癌MKN45細胞體外移行和侵襲能力均有不同程度降低(P<0.05或P<0.01)。轉(zhuǎn)染。Decoy ODN后的胃癌細胞中E-cadherin表達均顯著高于對照組細胞中的相應值(P<0.05)，ICAM-1、CD44v6、MMP-2和MMP-9表達均顯著低于對照組細胞中的相應值(P<0.05或P<0.01)。 結(jié)論：①STAT3與胃癌腹膜種植行為關(guān)系密切，其表達水平可作為判斷胃癌侵襲轉(zhuǎn)移、術(shù)后