小鼠附睪特異蛋白LCN6的轉(zhuǎn)錄調(diào)控和多克隆抗體的制備.pdf

1、附睪是精子成熟和儲存的重要場所，精子在穿越附睪的過程中與不斷變化的附睪微環(huán)境相互作用而逐漸成熟，獲得運動和受精的能力，而附睪特殊的微環(huán)境變化歸因于附睪基因的表達和調(diào)控的結(jié)果.本課題研究的mLCN6(mouse lipocalin6)是我們實驗室根據(jù)大鼠LCN6基因首次從小鼠附睪中克隆得到的同源基因，在附睪頭部特異表達，經(jīng)序列和二級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明該基因?qū)儆趌ipocalin家族。本課題將深入研究mLCN6的基因特性，我們以往的研究表明，mL

2、CN6通過變異剪切產(chǎn)生兩個主要轉(zhuǎn)錄本，分別命名為mLCN6α和mLCN6β；原位雜交結(jié)果表明該基因在附睪起始段及近端頭部特異表達；發(fā)育性變化表明該基因在出生后3周開始出現(xiàn)，并且在性活躍期和成年期間保持較高水平，老年以后隨時間逐步下降，說明該基因可能受雄激素調(diào)控并且與精子的成熟和生殖水平密切相關(guān)。
　　 本論文的第一部分研究工作旨在探討小鼠附睪上皮細胞中的mLCN6 mRNA表達的調(diào)控。我們用Northern Blot的方法對閹割

3、后及雄激素注射后小鼠附睪中mLCN6mRNA的表達進行分析，結(jié)果表明：mLCN6 mRNA在小鼠附睪中的表達與血清中睪酮的濃度呈正相關(guān)。閹割后mLCN6 mRNA表達迅速下降，皮下注射睪酮后，mLCN6mRNA的表達先升后降，但并沒有恢復(fù)到閹割前水平。輸出小管結(jié)扎以后阻止了睪丸中的流體進入附睪但并不影響雄激素的分泌，Northern Blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)結(jié)扎側(cè)附睪mLCN6 mRNA表達水平顯著低于對照側(cè)，通過時間的變化還發(fā)現(xiàn)結(jié)扎后第一天結(jié)

4、扎側(cè)附睪mLCN6 mRNA表達水平就已經(jīng)顯著下調(diào)，并隨時間推移始終保持較低水平。RT-PCR結(jié)果表明mLCN6α和mLCN6β受雄激素和睪丸因子影響是相同的。以上實驗結(jié)果提示mLCN6基因在附睪中受雄激素和睪丸因子共同調(diào)控。
　　 為了從蛋白質(zhì)水平深入研究mLCN6α和mLCN6β在精子成熟中的作用以及這兩個isoform在蛋白水平上的表達差異，需要制備特異性抗體。因此，我們在大腸桿菌中分別表達了mLCN6α和mLCN6β共有

5、的一條含118個氨基酸的肽段和將mLCN6α特有的58個氨基酸雙拷貝串聯(lián)起來的肽段，分別命名為mLCN6C和mLCN6D；通過SDS-PAGE凝膠蛋白電泳及電洗脫純化這兩個目的蛋白，并將純化的目的蛋白分別免疫新西蘭大白兔，得到了兩種抗血清；經(jīng)ELISA和Western印跡檢測證明得到了兩種效價比較高、特異性比較好，并且能夠分別特異性結(jié)合mLCN6C和mLCN6D融合蛋白的抗血清，為進一步探索mLCN6的功能提供了重要的基礎(chǔ)。