小鼠干擾素誘導(dǎo)蛋白IFIT1多克隆抗體的制備及應(yīng)用.pdf

1、第一部分：小鼠干擾素誘導(dǎo)蛋白IFIT1多克隆抗體的制備。 目的：獲取小鼠IFIT1(Interferon-induced protein withtetratricopetide repeats 1)特異性多克隆抗體，為深入研究IFIT1的結(jié)構(gòu)和功能奠定基礎(chǔ)。 方法：擴(kuò)增培養(yǎng)高效表達(dá)IFIT1的重組子pMAL-C<,2>X-IFIT1，超聲破碎后的細(xì)胞上清過(guò)Amylose Pre-packed column親和層析柱，將

2、所得純化的融合蛋白MBP-IFIT1作為抗原，添加福氏佐機(jī)劑后免疫兔，收集抗血清，Western blot和ELISA方法測(cè)定抗血清特異性反應(yīng)和效價(jià)。 結(jié)果：純化的MBP-IFIT1可誘導(dǎo)兔產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，所得抗體能夠特異性識(shí)別融合蛋白中的IFIT1，ELISA結(jié)果顯示其效價(jià)為1∶12800。 結(jié)論：MBP-IFIT1具有良好的抗原性，以該融合蛋白為抗原免疫兔成功制備出IFIT1特異性多克隆抗體。 第二部分：小

3、鼠多器官及細(xì)胞株干擾素誘導(dǎo)蛋白IFIT1的表達(dá)情況。 目的：觀察小鼠多器官和多細(xì)胞株干擾素誘導(dǎo)蛋白IFIT1 RNA水平的表達(dá)情況。 方法：將10只雄性正常小鼠C57/129小鼠斷頸處死，取心、肝、脾、肺、腎、小腸、淋巴細(xì)胞和骨骼肌提RNA。用5μg/ml的內(nèi)毒素(LPS)刺激Raw264.7細(xì)胞株、3T3細(xì)胞株和10T1/2細(xì)胞株5h后，終止刺激，收集細(xì)胞提RNA，同時(shí)設(shè)定正常對(duì)照組。將提純的RNA分別進(jìn)行RT-PCR，

4、觀察IFIT1的表達(dá)情況。 結(jié)果：小鼠心、肝、脾、肺、腎、小腸、淋巴細(xì)胞和骨骼肌中均表達(dá)IFIT1，且存在表達(dá)量上的差別，心表達(dá)量最高，肝與小腸比較P=0.307，其它各組織間比較P<0.05。Raw264.7細(xì)胞株、3T3細(xì)胞株和10T1/2細(xì)胞株LPS刺激5h后，均能誘導(dǎo)IFIT1表達(dá)，正常對(duì)照組表達(dá)為陰性。 結(jié)論：IFIT1在小鼠體內(nèi)為廣泛表達(dá)，LPS刺激可多種細(xì)胞株表達(dá)IFIT1。 第三部分：放射性損傷對(duì)小

5、鼠干擾素誘導(dǎo)蛋白IFIT1及JAB1表達(dá)的影響。 目的：觀察放射性損傷后早期小鼠肝組織IFIT1、JAB1各時(shí)相點(diǎn)變化特點(diǎn)，初步探討創(chuàng)傷應(yīng)激早期糖皮質(zhì)激素抵抗的分子機(jī)制。 方法：將20只C57小鼠，不拘雌雄，隨機(jī)分為正常對(duì)照組和致傷組，致傷組采用5Gry<'60>Co一次性全身照射，分別于傷后1h、4h、和12h脫頸處死取肝組織。用western blot測(cè)定肝組織IFIT1、JAB1表達(dá)變化。結(jié)果：放射損傷后1h IFI

6、T1開(kāi)始增高，12h達(dá)最高，呈上升趨勢(shì)，差異顯著P<0.01；同時(shí)，JAB1在1h開(kāi)始下降，12h降到最低，呈下降趨勢(shì)，差異顯著P<0.01。 結(jié)論：放射損傷早期不僅引起小鼠肝組織IFIT1的顯著增高，同時(shí)引起JAB1的顯著下降，成相反趨勢(shì)，揭示創(chuàng)傷應(yīng)激早期糖皮質(zhì)激素抵抗可能與IFIT1對(duì)其的阻遏作用和JABl對(duì)其的正性調(diào)控有關(guān)。 第四部分：頸交感神經(jīng)阻滯對(duì)燒傷早期小鼠肝干擾素誘導(dǎo)蛋白IFIT1表達(dá)的影響。 目的：

7、探討頸交感神經(jīng)阻滯(cervicall sympathetic block，SB)對(duì)燒傷后早期小鼠肝臟干擾素誘導(dǎo)蛋白IFIT1表達(dá)的影響。 方法：雄性C57/129小鼠50只，隨機(jī)分為對(duì)照組和SB治療組，TBSA 15-20％Ⅲ度小鼠燒傷模型，分別于燒傷前、燒傷后1h、6h、12h和24h取肝組織，采用免疫印跡法(Westem blot)觀察IFIT1的蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果：對(duì)照組燒傷后肝IFIT1表達(dá)顯著增高(P<0.