殼聚糖納米粒固定化凝血酶的制備及應(yīng)用的初步研究.pdf

1、止血是外科手術(shù)的基本操作，傳統(tǒng)止血方法遇有不可控制的出血時(shí)效果欠佳。新型止血敷料是新近研發(fā)的一種局部快速止血材料，通過加強(qiáng)局部凝血因子濃度、血小板數(shù)量和質(zhì)量、血管收縮功能等生理止血因素，并結(jié)合堵塞、壓迫、熱止血等傳統(tǒng)方法，達(dá)到快速止血的目的，有些還具有多功能敷料的特性。它的應(yīng)用使外科的這一止血現(xiàn)狀大為改善。但是，現(xiàn)有新型止血敷料尚存在環(huán)境穩(wěn)定性、副損傷、止血效果不確切、價(jià)格昂貴等多方面問題。 納米止血材料是外科止血領(lǐng)域的最新發(fā)展

2、。納米材料有著獨(dú)特的性質(zhì)(如表面效應(yīng)、尺寸效應(yīng)、隧道效應(yīng)等)，使之為外科止血提供了獨(dú)立于縫扎、電凝、填塞、促進(jìn)凝血栓形成等方法之外的新途徑。但是納米止血技術(shù)剛剛起步，有待完善。 酶固定化技術(shù)使提高現(xiàn)有止血?jiǎng)┑沫h(huán)境穩(wěn)定性成為可能，特別是提高凝血酶等生物止血材料的穩(wěn)定性，有著獨(dú)特的優(yōu)勢。當(dāng)前，已有固定化凝血酶的文獻(xiàn)報(bào)道。納米技術(shù)固定化酶可以有效減小空間效應(yīng)、分配效應(yīng)、擴(kuò)散效應(yīng)等多種效應(yīng)對(duì)酶動(dòng)力學(xué)的影響，最大限度提高酶活性收率，但尚未

3、發(fā)現(xiàn)關(guān)于納米技術(shù)固定化凝血酶的相關(guān)研究。 本論文著眼于手術(shù)和急救的止血需要，整合納米技術(shù)、酶固定化技術(shù)于新型止血材料中，提出以下設(shè)想： 1．以天然止血材料殼聚糖為原材料，運(yùn)用離子交聯(lián)技術(shù)，制備納米粒，實(shí)現(xiàn)止血材料的納米化，從而改變殼聚糖的止血特性，同時(shí)進(jìn)一步研究納米止血材料的止血機(jī)理。 2．以殼聚糖納米粒為載體，運(yùn)用酶固定化技術(shù)，對(duì)凝血酶進(jìn)行改性，提高其環(huán)境穩(wěn)定性，拓寬其使用范圍，為發(fā)展新一代納米止血材料做基礎(chǔ)研

4、究。 第一部分：殼聚糖納米微粒的制備及表征 研究內(nèi)容： 本部分內(nèi)容著眼于運(yùn)用離子交聯(lián)法制備合適的粒徑較小的殼聚糖納米粒固定化酶載體，以期減小固定化過程和固定化載體對(duì)酶動(dòng)力學(xué)的影響，得到最大的酶活性收率，為下面的實(shí)驗(yàn)做基礎(chǔ)研究。 結(jié)果： 在最佳條件下制得的納米粒粒徑最小，平均粒徑為28.4nm，粒徑分布較集中，可滿足納米粒固定化酶載體的要求。經(jīng)TEM觀察，粒子成球性好。紅外光譜研究顯示，殼聚糖分子的

5、氨基與TPP的磷酸基之間有較強(qiáng)的靜電結(jié)合作用。 結(jié)論： 以殼聚糖和三聚磷酸鈉為載體材料，采用離子交聯(lián)法制備CS-TPP納米粒，該納米微粒粒徑小，成球性較好，可滿足未來固定化凝血酶的要求。 第二部分：殼聚糖納米粒固定化凝血酶的制備及性質(zhì) 研究內(nèi)容： 本部分集中研究殼聚糖固定化凝血酶(CS-TPP-TH納米粒)的制備方法、影響因素，進(jìn)而探討CS-TPP-TH納米粒的包封率、載藥率以及其活性收率和環(huán)境穩(wěn)

6、定性。 結(jié)果： 凝血酶初始量影響到CS-TPP-Th納米粒粒徑，Th/CS=0.8時(shí)，CS-TPP-Th納米粒粒徑最小為35.3nm，同時(shí)還影響其包封率和載藥率。CS-TPP-Th納米粒的最適溫度為40℃，最適pH值為6.9，37℃環(huán)境下活性收率為66.96﹪，半衰期為120h。 結(jié)論： CS-TPP納米粒通過納米粒包埋法、電荷吸附法固定化凝血酶，可以不改變凝血酶的結(jié)構(gòu)；同時(shí)，納米級(jí)的固定化載體，減小了空

7、間效應(yīng)、分配效應(yīng)、擴(kuò)散效應(yīng)對(duì)固定化凝血酶的活性影響，因此，在大幅度提高固定化酶的穩(wěn)定性的同時(shí)，保證了較大的酶活性收率。 第三部分：殼聚糖納米粒固定化凝血酶的凝血功能檢測和動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 研究內(nèi)容： 本部分實(shí)驗(yàn)通過對(duì)CS-TPP-Th納米粒的實(shí)驗(yàn)室檢測，對(duì)其凝血功能及機(jī)理進(jìn)行評(píng)估與研究，進(jìn)而研究納米止血材料的止血機(jī)理；最后制作多種動(dòng)物出血模型，對(duì)CS-TPP-Th納米粒凍干粉進(jìn)行初步的應(yīng)用研究。 結(jié)果：

8、CS-TPP-Th納米粒和殼聚糖對(duì)RBC聚集性的影響沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，前者可明顯減少凝血時(shí)間(P<0.05)；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，CS-TPP-Th納米粒凍干粉可以用于各種類型的出血?jiǎng)?chuàng)面，可明顯縮短創(chuàng)面的即時(shí)止血時(shí)間、減少出血量(P<0.05)，降低再出血發(fā)生率和死亡率；組織學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)明顯的纖維組織增生，且部分納米粒已經(jīng)被吸收。 結(jié)論： CS-TPP-Th納米粒通過納米粒的表面效應(yīng)、影響RBC聚集、凝血酶的直接作