人結(jié)締組織生長(zhǎng)因子ABC-EIA檢測(cè)方法的建立及初步臨床應(yīng)用.pdf

1、研究目的：器官和組織纖維化是眾多疾病發(fā)展的終末階段，它能導(dǎo)致心、肝、腎等重要臟器的結(jié)構(gòu)改變，功能喪失。研究表明，結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)在心肌梗死、糖尿病、糖尿病腎病、腫瘤等多種疾病狀態(tài)中皆有不同程度的表達(dá)上調(diào)。目前CTGF的檢測(cè)主要依靠RT-PCR、WesternBlot、IH等方法，尚無商品化ELISA檢測(cè)試劑盒的報(bào)道，為能簡(jiǎn)便、快速的檢測(cè)疾病狀態(tài)下CTGF的表達(dá)情況，探討其與器官組織纖維化之間的關(guān)聯(lián)，建立檢測(cè)人血清中CTGF的

2、ABC-EIA法，該方法簡(jiǎn)便、高效、靈敏度高，可以大批量檢測(cè)各種體液標(biāo)本，ABC-EIA的建立可能為臨床纖維化疾病的早期診斷提供一個(gè)新的檢測(cè)指標(biāo)；同時(shí)利用所建方法檢測(cè)高血壓病人以及正常人血清中CTGF水平，探討其在人體內(nèi)異常表達(dá)的意義，為臨床應(yīng)用打下基礎(chǔ)。 研究方法： 1．利用DNA重組技術(shù)，從血管內(nèi)皮細(xì)胞中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，設(shè)計(jì)特異引物，擴(kuò)增CTGF C區(qū)基因，插入質(zhì)粒表達(dá)載體，陽(yáng)性質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL

3、21(DE3)，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)溶菌酶處理、超聲破碎后，用Histrap Kit和SephedexG-200純化，獲得CTGF標(biāo)準(zhǔn)品及抗原；以重組CTGF為免疫原，采用皮下多點(diǎn)注射法制備CTGF多克隆抗體；雜交瘤技術(shù)獲得穩(wěn)定分泌CTGF單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，將其中效價(jià)和相對(duì)親和力較高的7C7細(xì)胞株復(fù)蘇培養(yǎng)后注射于BAL,B/c小鼠腹腔，誘導(dǎo)產(chǎn)生腹水；采用離子交換層析法純化單抗和多抗；間接ELISA檢測(cè)純化后單抗和多抗的效價(jià)和

4、相對(duì)親和力，并用SDS-PAGE鑒定所得CTGF標(biāo)準(zhǔn)品、單抗、多抗的純度；Western Blot鑒定單抗的特異性。 2．比較生物素-親和素用于顯色系統(tǒng)和捕獲系統(tǒng)，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，建立ABC-EIA法，并對(duì)其在靈敏度、批內(nèi)差異、批間差異、回收試驗(yàn)、干擾試驗(yàn)(血紅蛋白、膽紅素、三酰甘油)等方面作評(píng)價(jià)。利用所建立的ABC-EIA方法檢測(cè)標(biāo)本中CTGF的水平。 結(jié)果： 1．CTGF標(biāo)準(zhǔn)品純化后用SDS-PAGE鑒定純度，

5、顯示在30KD處出現(xiàn)單一蛋白條帶，與預(yù)期分子量一致。采用SDS-PAGE鑒定單抗和多抗的純度，結(jié)果顯示在25KD和50KD處各有一條帶，分別為免疫球蛋白的輕鏈和重鏈。用Western Blot鑒定單抗的特異性，結(jié)果顯示在30KD處有一條帶，即重組CTGF的位置。間接ELISA結(jié)果顯示：?jiǎn)慰?、多抗的效價(jià)分別為2.0×10<'3>、4.0×10<'3>，相對(duì)親和力分別為6.0×10<'7>、7.5×10<'8>； 2.生物素-親和素

6、用于顯色系統(tǒng)優(yōu)于用于捕獲系統(tǒng)，ABC-EIA方法的靈敏度為1.0 ng/mL，批內(nèi)、批間差異分別為5.4％、7.5％，平均回收率104.2％，血紅蛋白濃度在0～50 mmol/L、總膽紅素在0～150umol/L、三酰甘油在0～2.0 mmol/L對(duì)測(cè)定結(jié)果無影響。 3.120例高血壓病人總體血清CTGF平均水平明顯高于正常健康對(duì)照組，差異顯著(p<0.05)；高血壓合并急性心肌梗死組，高血壓合并心絞痛組和單純高血壓組CTGF平

7、均水平明顯均高于正常健康對(duì)照組，比較差異顯著(p<0.05，p<0.05，p<0.05)；其中，高血壓合并急性心肌梗死組CTGF平均水平明顯高于高血壓合并心絞痛組和單純高血壓組，且比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05，p<0.05)；高血壓合并心絞痛組和單純高血壓組比較差異不顯著(p>0.05)。 結(jié)論： 1.制備的CTGF標(biāo)準(zhǔn)品、單克隆抗體和多克隆抗體經(jīng)SDS-PAGE鑒定純度在95％以上，Westem Blot結(jié)果顯示單抗