MACC1基因在胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)中的臨床意義及其可能機制探索.pdf

1、研究背景和目的：
　　 結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1(metastasis associated in colon cancer-1，MACC1)最早是在結(jié)腸癌中發(fā)現(xiàn)其為癌基因，與結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)。MACC1是肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)/肝細(xì)胞生長因子受體(Met tyrosinekinase receptor，c-Met)信號傳導(dǎo)通路的重要調(diào)節(jié)因子。c-Met基因是上世紀(jì)80年代發(fā)

2、現(xiàn)的一個癌基因，HGF是c-Met受體唯一的配體，當(dāng)其表達異常時，HGF與c-Met受體結(jié)合后激活RAS-有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedprotein kinase，MARK)、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol3-kinase，PI3K)-絲氨酸/蘇氨酸激酶(Serine/threonine kinase，Akt)、信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(Signal transducers an

3、d activators of transcription，STAT)信號傳導(dǎo)通路，發(fā)揮促細(xì)胞增殖、侵襲、血管生成和抗凋亡等功能，與包括結(jié)直腸癌、胃癌、肝癌、肺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤發(fā)生及預(yù)后相關(guān)。
　　 MACC1基因位于7號染色體上(7p21.1)，含有七個外顯子和六個內(nèi)含子，其cDNA含2559個核苷酸，編碼的蛋白含852個氨基酸殘基。MACC1基因與腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)性首先由Stein等在結(jié)腸癌中被發(fā)現(xiàn)，MACC1高表達的患者

4、術(shù)后轉(zhuǎn)移發(fā)生的時間短于低表達的患者，是影響結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移和無轉(zhuǎn)移生存時間長短的獨立因素;MACC1表達對結(jié)腸癌患者預(yù)后也有影響，低表達的患者五年生存率高達80％，而MACC1高表達的患者五年生存率僅15％;此外，基于無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者結(jié)腸癌原發(fā)灶MACC1的表達情況，其在預(yù)測發(fā)生異時性轉(zhuǎn)移和未發(fā)生異時性轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌患者準(zhǔn)確率高達74％和80％，可有效地預(yù)測結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移;在構(gòu)建的結(jié)腸癌細(xì)胞株中，MACC1高表達的細(xì)胞運動力和增殖力明顯高于干擾MAC

5、C1表達組;在異種移植的小鼠模型中也發(fā)現(xiàn)，MACC1明顯促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。隨后，更多的研究支持stein等人的觀點，發(fā)現(xiàn)MACC1與結(jié)直腸癌的TNM分期、腹膜轉(zhuǎn)移也具有相關(guān)性，其表達在Ⅳ期患者中明顯高于Ⅰ-Ⅲ期患者，在發(fā)生腹膜轉(zhuǎn)移的患者中也明顯高于未發(fā)生腹膜轉(zhuǎn)移者。在肺癌、肝癌、胰腺癌、卵巢癌、膀胱癌等惡性腫瘤中也發(fā)現(xiàn)，MACC1可影響癌癥患者的預(yù)后或術(shù)后復(fù)發(fā)，可促進腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲。
　　 在胃癌方面，關(guān)于MACC1的

6、作用了解甚少。近期一項臨床研究表明，MACC1在胃癌發(fā)生腹膜轉(zhuǎn)移的患者中表達量比未發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者更高。目前，在全球惡性腫瘤中死亡率排名第二位的胃癌，外科手術(shù)仍然是其治愈的唯一方式，但即使行根治性切除術(shù)后仍有約一半的患者會面臨腫瘤復(fù)發(fā)，而腫瘤一旦發(fā)生復(fù)發(fā)，則嚴(yán)重影響患者的預(yù)后。在發(fā)生術(shù)后復(fù)發(fā)的患者中，其中有很大一部分是因為出現(xiàn)了血行和腹膜轉(zhuǎn)移，其原因可能是在術(shù)前腫瘤細(xì)胞就已經(jīng)發(fā)生了不可察覺的微轉(zhuǎn)移。人們普遍認(rèn)為上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變(epithe

7、lial-to-mesenchymal，EMT)是腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的非常重要的因素。EMT發(fā)生過程是腫瘤細(xì)胞發(fā)生從上皮細(xì)胞表型到間質(zhì)細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)化，從細(xì)胞間連接和周圍基質(zhì)的束縛中脫離出來，形成單個的腫瘤細(xì)胞，從而侵襲周圍組織，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。目前公認(rèn)的與EMT發(fā)生相關(guān)的分子標(biāo)志包括:間質(zhì)表型相關(guān)基因表達上調(diào)，如波形蛋白(vimentin)、N-鈣粘蛋白(N-cadherin)、纖連蛋白(Fibronectin)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2、

8、基質(zhì)金屬蛋白酶-3、基質(zhì)金屬蛋白酶-9等;上皮表型相關(guān)基因表達下調(diào)，如E-鈣粘蛋白(E-cadherin)、橋粒斑蛋白(desmoplakin)、細(xì)胞角蛋白(cytokeratin)等。誘導(dǎo)EMT發(fā)生的機制涉及多條信號傳導(dǎo)通路，而且各通路之間相互影響，關(guān)系錯綜復(fù)雜。HGF、成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)、血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor，PD

9、F)可通過酪氨酸激酶受體(receptortyrosine kinases，RTK)激活Ras-Raf-MAPK信號通路，或作用于PI3K、Src-STAT信號通路而作用于EMT。轉(zhuǎn)化生長因子(ransforming growth factor，TGF)-β通過絲氨酸/酪氨酸激酶受體(receptor serine/threonine kinases，RS/TK)激活R-Smad/Co-Smad通路，或作用于PI3K和MARK通路，TG

10、F-β受體信號通路也可直接作用于極性蛋白Par6，抑制Rho的表達，導(dǎo)致上皮細(xì)胞間緊密連接松解;Wnt配體信號通路也是調(diào)控EMT的重要途徑之一，它可與跨膜受體結(jié)合，作用于β-連環(huán)蛋白(β-catenin)和轉(zhuǎn)錄因子LEF-1/TC而作用于EMT。這些信號通路都可調(diào)控EMT相關(guān)基因的而導(dǎo)致EMT的發(fā)生和細(xì)胞運動性改變。
　　 在結(jié)腸癌中已證實，MACC1是c-Met基因的上游轉(zhuǎn)錄激活因子，可調(diào)控HGF/c-Met信號通路，而HGF

11、/c-Met信號通路可促進胃癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移，同時，該信號通路失調(diào)也可誘導(dǎo)EMT的發(fā)生。因此，MACC1是否與胃癌的術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)，是否通過調(diào)控EMT的發(fā)生而改變胃癌的惡性生物學(xué)行為？我們下面的研究將致力于解決這些疑問。
　　 在本篇研究中，我們首先回顧性研究264例Ⅰ-Ⅲ期已行胃癌根治手術(shù)的患者資料，分析MACC1對胃癌根治術(shù)后復(fù)發(fā)的影響，及其表達與患者臨床病理學(xué)參數(shù)之間的關(guān)系;其次，在體外細(xì)胞實驗中研究MACC1表達水平改變對胃

12、癌細(xì)胞侵和遷移能力的影響，并進一步探索其是否通過調(diào)控EMT發(fā)生而影響胃癌的惡性生物學(xué)行為。
　　 研究方法：
　　 1.檢測Ⅰ-Ⅲ期行胃癌根治性切除手術(shù)患者的癌組織標(biāo)本中MACC1蛋白的表達情況，并分析其臨床意義。
　　 收集2004至2008年在南方醫(yī)院行胃癌根治性切除手術(shù)的患者共264例，所有患者均經(jīng)病理診斷為胃癌，并達到R0切除。根據(jù)2010年第7版AJCC胃癌分期標(biāo)準(zhǔn)進行分期。隨訪患者從手術(shù)到腫瘤復(fù)發(fā)的時

13、間，隨訪截止時間為2011年3月。
　　 取患者手術(shù)癌組織標(biāo)本進行石蠟包埋，將癌組織石蠟塊制成4mm厚的石蠟切片，用免疫組織化學(xué)的實驗方法檢測MACC1蛋白表達，根據(jù)染色范圍和染色深淺進行評分，結(jié)合患者的臨床病理學(xué)特征，統(tǒng)計分析MACC1表達高低是否與胃癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)及復(fù)發(fā)時間長短有所關(guān)聯(lián)。這種關(guān)聯(lián)是否受年齡、性別、分期等影響。
　　 2.構(gòu)建MACC1過表達及沉默穩(wěn)轉(zhuǎn)人胃癌細(xì)胞株
　　 根據(jù)MACC1基因序列，

14、設(shè)計擴增或干擾MACC1表達的質(zhì)粒，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)錄病毒，感染BGC-823、MKN-28人胃癌細(xì)胞株，構(gòu)建MACC1過表達細(xì)胞(MACC1)，對照空載細(xì)胞(vector)，MACC1沉默細(xì)胞(shMACC1)，對照無關(guān)序列細(xì)胞(scramble)。采用熒光實時定量(Real-time，RT) PCR和Westernblot方法檢測細(xì)胞株中MACC1的mRNA及蛋白含量，鑒定是否成功構(gòu)建MACC1過表達及沉默的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。
　　

15、 3.檢測MACC1表達改變對胃癌細(xì)胞株侵襲和遷移的影響。
　　 采用Transwell實驗方法比較MACC1不同表達水平的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞之間侵襲能力的差異，采用劃痕實驗比較遷移能力的差異。
　　 4.檢測MACC1表達水平改變對EMT相關(guān)基因表達的調(diào)控。
　　 采用RT-PCR和Western blot實驗方法檢測MACC1不同表達水平的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞EMT相關(guān)基因的表達情況，包括E-鈣粘蛋白、α-連環(huán)蛋白、纖連蛋白、MM

16、P2、MMP9、波形蛋白、CD44基因的mRNA和蛋白含量。
　　 5.統(tǒng)計學(xué)方法
　　 所以結(jié)果都應(yīng)用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。MACC1蛋白表達與胃癌患者術(shù)后無疾病進展生存(Disease free survival，DFS)時間關(guān)系用Kaplan-Meier法，MACC1蛋白表達與臨床病理學(xué)參數(shù)（性別、年齡、腫瘤分期、患者復(fù)發(fā)狀態(tài)）之間的關(guān)系用x2檢驗。風(fēng)險比(Hazard ratio，HR)用Cox模型

17、計算。PCR及Westernblot結(jié)果采用Student's-T檢驗。所有P值＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.MACC1在胃癌患者癌組織中的表達
　　 (1)在264例胃癌患者中，75.4％的患者癌組織MACC1表達陽性，24.6％表達陰性。
　　 (2) MACC1表達與患者性別(P=0.266)、年齡(P=0.446)無關(guān)，與臨床分期相關(guān)。在Ⅰ期患者中，MACC1表達陽性

18、率為62.8％，但Ⅱ-Ⅲ期患者中陽性率達77.8％，兩者間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.036)。
　　 (3) MACC1與胃癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)，其中在發(fā)生復(fù)發(fā)的患者中，84.2％的患者MACC1表達陽性，在未發(fā)生復(fù)發(fā)的患者中，MACC1表達陽性占60.6％，P＜0.001，有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 (4) MACC1表達陽性胃癌患者術(shù)后DFS明顯短于表達陰性患者，尤其在Ⅱ-Ⅲ期的患者中，MACC1是影響胃癌DFS的獨立因素

19、。
　　 2.MACC1促進胃癌細(xì)胞的侵襲和遷移
　　 與對照組相比，MACC1過表達組細(xì)胞通過Transwell小室的細(xì)胞數(shù)量更多，MACC1沉默組細(xì)胞通過Transwell小室的細(xì)胞數(shù)量則較少，表明MACC1表達量越高，胃癌細(xì)胞侵襲能力越強。在劃痕實驗中，MACC1過表達組細(xì)胞向劃痕邊緣爬行速度最快，劃痕寬度明顯變窄，而MACC1沉默組細(xì)胞向劃痕邊緣爬行速度最慢，殘留的劃痕寬度最寬，表明MACC1表達越高，胃癌細(xì)胞遷

20、移能力越強。
　　 3.MACC1可調(diào)控EMT相關(guān)基因的表達
　　 與對照組相比，MACC1過表達組細(xì)胞上皮細(xì)胞標(biāo)志E-鈣粘蛋白、α-連環(huán)蛋白mRNA和蛋白含量較低，間葉轉(zhuǎn)化相關(guān)的纖連蛋白、波形蛋白、MMP2、MMP9、CD44的mRNA和蛋白含量明顯升高; MACC1沉默組細(xì)胞的結(jié)果則與之相反，統(tǒng)計分析P值均＜0.05，具有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 研究結(jié)論：
　　 1.MACC1與胃癌根治術(shù)后患者分期及復(fù)發(fā)