產(chǎn)紫杉醇真菌NK-101關鍵基因的功能研究與營養(yǎng)缺陷型菌株的構建.pdf

1、紫杉醇類化合物具有三環(huán)二萜的骨架結構，最初是從紅豆杉等植物中分離獲得。研究發(fā)現(xiàn)，紫杉醇是一種高效、低毒、應用廣譜、作用機制獨特的天然抗腫瘤藥物。但是由于受到原料來源和提取技術的制約，長期以來紫杉醇類藥物在市場上處于供不應求的狀態(tài)。近年來，應用植物內生真菌發(fā)酵大規(guī)模生產(chǎn)紫杉醇的技術取得了一定進展，為提高紫杉醇的產(chǎn)量開辟了新的途徑，將會帶來巨大的市場前景和經(jīng)濟效益。
　　 近二十年來，擬盤多毛孢屬(Pestalotiopsis ge

2、nus)真菌由于能產(chǎn)生大量的具有生物活性的天然產(chǎn)物，越來越引起人們的關注。但是目前的許多研究報道還只停留在宏觀的水平，對其深入的分子層面的研究還很少。本實驗室篩選到一株產(chǎn)紫杉醇的擬盤多毛孢屬真菌NK-101，經(jīng)過形態(tài)學和分子生物學上的分析鑒定，認為NK-101屬于Pestalotiopsis malicola。目前本實驗室已經(jīng)對NK-101進行de novo全基因組測序，首次獲得擬盤多毛孢屬真菌的基因組信息，為全面研究NK-101菌株中

3、關鍵基因功能奠定了基礎。
　　 本實驗通過氨基酸序列比對，得到了NK-101菌株中與加拿大紅豆杉（Taxuscanadensis）中苯丙氨酸氨基變位酶（phenylalanine aminomutase）(GenB ank:AAT47186.1)和美國短葉紅豆杉（Taxus brevifolia）中紫杉二烯合成酶(taxadienesynthase)(GenBank: U48796)同源性較高的基因，將其分別命名為PAM基因和T

4、S基因;通過農(nóng)桿菌介導的絲狀真菌轉化的方法，將敲除質粒轉入NK-101菌株中并將PAM基因和TS基因定向敲除，獲得△pam和△ts菌株。通過對比野生型NK-101菌株和敲除菌株的菌落形態(tài)、產(chǎn)孢能力、菌絲生物量以及次級代謝產(chǎn)物合成能力等多種指標，推測PAM基因和TS基因的功能并做進一步的研究。
　　 同時，將NK-101菌株中URA-3基因和ADE基因進行定向敲除，得到了尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株和腺嘌呤營養(yǎng)缺陷型菌株，為絲狀真菌的轉化